《Cell Reports Medicine》：Antibody escape drives emergence of diverse spike haplotypes resembling variants of concern in persistent SARS-CoV-2 infections
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本研究针对持续性SARS-CoV-2感染中病毒进化机制不清的问题，通过开发高精度长读长测序技术（HaploVar v1.0），系统解析了免疫缺陷个体中刺突蛋白（Spike）单倍型的动态演化。研究发现，长期感染可加速病毒进化，驱动中和抗体逃逸突变在变异株关键位点（如RBD、NTD）富集，并在一例506天感染病例中模拟出Omicron样变异株的进化路径。该成果发表于《Cell Reports Medicine》，为变异株起源提供了直接证据，对预警未来流行株具有重要意义。
新型冠状病毒（SARS-CoV-2）变异株（Variants of Concern, VOCs）的突然出现一直是疫情应对中的核心难题。这些变异株往往携带大量突变，尤其是病毒表面刺突蛋白（Spike）的关键区域，导致其传播力、免疫逃逸能力显著增强。目前学术界对其起源存在三种假说：隐匿传播链、跨物种传播以及持续性感染。其中，免疫缺陷个体的长期感染被越来越多证据支持为重要源头。然而，由于常规测序技术难以准确解析病毒群体内共存的多种突变组合（即单倍型），持续性感染如何具体驱动变异株诞生，其内部进化动态与免疫压力间的相互作用，仍不清晰。
为回答这一问题，由Snell等领导的研究团队在《Cell Reports Medicine》上发表了最新成果。他们开发了一套名为HaploVar v1.0的高精度纳米孔长读长测序流程，能够以单次读取覆盖整个刺突基因，准确识别低至5%频率的单倍型。利用该技术，研究人员对23名免疫缺陷患者（感染持续时间39至506天）的123份纵向样本进行了深入分析，并与69例急性感染样本进行对比。
研究首先证实，持续性感染样本中的刺突单倍型数量显著多于急性感染，且多样性随感染时间延长而增加。通过分子钟分析发现，部分病例的进化速率远超全球流行株，例如患者P2的刺突蛋白在506天感染中积累55个氨基酸突变，进化距离接近Omicron BA.1。更重要的是，这些突变非随机分布，主要富集于受体结合域（RBD）和N端结构域（NTD）等抗原关键区域，且多位点为已知VOC标志性突变（如L452R、E484K/Q/R、H655Y等）。选择压力分析显示，65%的单倍型呈现正向选择（dN-dS > 0），36个位点检测到间歇性多样化选择，其中16个与VOC相关。
研究进一步追踪了单克隆抗体（mAb）治疗对病毒进化的影响。在10例接受索托维单抗（Sotrovimab）治疗的患者中，7例出现已知逃逸突变（如P337L、E340A）；而接受卡西瑞单抗（Casirivimab）和伊德维单抗（Imdevimab）联合治疗的患者则快速产生E484Q、Q493E等耐药突变。这表明治疗压力可迅速筛选出逃逸株，提示临床需谨慎评估mAb在持久感染中的应用。
为直接揭示免疫压力与病毒进化的因果关系，研究团队对一例506天感染病例（患者P2）进行深入表型验证。通过构建不同时间点的刺突蛋白假病毒，发现病毒逐步获得对自体血清的逃逸能力：早期血清可中和初始病毒（D614G），但对后期分离株（如第329天）无效。更重要的是，第329天病毒对16份第一波疫情康复者血清的中和滴度下降15.1倍，但对奥密克戎时期血清仍敏感，其逃逸特征与Omicron相似。利用14株单克隆抗体的精细图谱分析进一步显示，突变积累导致对疫苗 elicited 抗体的敏感性逐步丧失，尤其是Group 4表位抗体。
本研究的关键技术方法包括：基于纳米孔R10.4.1流道的高精度长读长测序（Q30读数）、针对全长刺突基因的单倍型解析流程（HaploVar v1.0）、假病毒中和实验体系、以及分子钟与选择压力分析算法（MEME、FEL等）。样本来源于英国圣托马斯医院收治的免疫缺陷患者队列。
主要研究结果
高精度长读长测序 workflow 揭示持续性感染中刺突单倍型多样性
通过对比急性和慢性感染样本，发现后者单倍型数量显著增多（中位数2 vs 1），且与感染时长正相关（Spearman r=0.506, p<0.0001）。技术验证表明，该方法可稳定检测≥5%频率的单倍型，测序深度不影响结果。
刺突单倍型分析显示加速进化、正向选择及VOC相关突变富集
进化速率分析显示多例患者速率超过全球VOCs，突变集中于RBD和NTD。患者P2携带7个VOC定义突变和11个VOC相关突变，其系统发育分支长度接近Omicron BA.1。正向选择广泛存在，且检测到多个位点（如R346、E484）的间歇性多样化选择。
单克隆抗体治疗驱动快速免疫逃逸突变涌现
在接受mAb治疗的患者中，靶向位点（如索托维单抗的P337、E340；卡西瑞单抗的E484、Q493）快速出现耐药突变，证实治疗压力可加速逃逸株演化。
长期感染中刺突蛋白逐步获得广泛中和抗体逃逸能力
对患者P2的纵向分析显示，病毒通过累积突变（如R346I、L455F、E406Q）逐步逃逸自体中和抗体，最终获得对第一波疫情血清的广泛抵抗，但对奥密克戎时期血清仍敏感。单克隆抗体中和图谱进一步揭示突变对不同表位抗体的差异化影响。
结论与讨论
本研究通过创新性单倍型解析技术，揭示了持续性SARS-CoV-2感染是驱动病毒加速进化、产生VOC类似突变的重要工厂。其核心机制在于长期免疫压力下，刺突蛋白通过累积关键位点突变实现逐步免疫逃逸。尤其值得注意的是，在Omicron出现前3个月，患者P2体内已独立演化出具有类似逃逸特征的病毒株，为VOC起源于持续性感染提供了强有力证据。
研究还指出，尽管这些高度演化的病毒在个体内具备强大逃逸能力，但其种群级传播可能受限于适应性权衡（如复制效率降低）。这一发现强调需加强对免疫缺陷人群的病毒进化监测，同时提示未来抗病毒策略需平衡疗效与耐药风险。该工作建立的单倍型解析框架亦可拓展至其他快速进化病原体研究，为预警新兴变异株提供技术支撑。
