《Microbiology Spectrum》：The P protein T25M substitution is involved in the quasispecies and virulence of Newcastle disease virus
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本研究通过鸡胚连续传代实验揭示新城疫病毒（NDV）弱毒株（斑鸠源）向中强毒力演化的关键分子事件。研究发现P基因T25M突变是病毒毒力增强的核心驱动因素，该突变通过改变磷蛋白结构增强病毒复制能力与免疫逃逸功能。实验通过反向遗传学构建重组病毒证实T25M突变可显著提高颅内致病指数（ICPI）和静脉致病指数（IVPI），并利用荧光标记病毒竞争实验证明该突变株在准种竞争中占据绝对优势。研究首次系统阐释了NDV准种动态演化与毒力关联机制，为RNA病毒适应性进化研究提供重要模型。
新城疫病毒P蛋白T25M替换参与准种和毒力研究
摘要
新城疫病毒（NDV）弱毒株斑鸠源经过鸡胚连续传代后获得增强的毒力。研究发现P基因T25M替换是特异性无病原（SPF）鸡胚中100次连续传代后致病性增强的关键决定因素。通过平均死亡时间（MDT）、颅内致病指数（ICPI）和静脉致病指数（IVPI）等指标验证，传代后病毒在DF-1和BHK-21细胞中复制能力提升，并引起呼吸系统和神经组织广泛病变。新一代测序技术鉴定出6个非同义突变，其中仅P蛋白T25M与毒力表型相关。
引言
新城疫病毒作为副黏病毒科禽腮腺炎病毒属成员，其毒力由病毒遗传因子和宿主免疫反应共同决定。融合蛋白（F）和血凝素神经氨酸酶（HN）是关键毒力因子，而P蛋白作为辅助蛋白在病毒复制、转录和免疫逃逸中发挥多重功能。研究采用2019年从秦岭北麓分离的基因IX型弱毒株（ICPI=0.425，MDT=64.8小时），通过鸡胚传代模型探讨病毒准种进化规律。
材料与方法
病毒在9日龄SPF鸡胚中进行100代连续传代，每代接种滴度为1×105PFU/mL。通过蚀斑纯化、细胞病变效应（CPE）观察和组织病理学分析评估毒力变化。利用Illumina NovaSeq 6000平台进行全基因组测序，并通过反向遗传学构建包含EGFP/mCherry荧光标记的重组病毒。
结果
病毒生长动力学分析
传代毒株在DF-1细胞中呈现更早的合胞体形成（图1D），病毒滴度在48小时达到4.25 log10TCID50/mL（图1B）。第100代毒株的ICPI从0.521升至1.43，MDT从96.1小时缩短至60.9小时（表1），IVPI从0.2升至1.9，表明毒力从中等向强毒力转变。
致病性测试
4周龄SPF鸡感染实验显示，第100代毒株引起70%的急性死亡率（表4），组织病毒载量显著升高（图2E），并出现脑组织血管周淋巴细胞浸润、脾脏坏死等典型病变（图5）。血凝抑制（HI）抗体应答减弱，提示免疫逃逸能力增强。
突变位点功能验证
基因组分析发现12个突变位点，其中P蛋白T25M和S369N、M蛋白S200N、HN蛋白N147D/I405L/K495N等6个位点被成功构建为重组病毒（图3A）。体外实验表明rDove100th-PT25M突变体合胞体形成能力最强（图3G），但复制能力在72小时后显著下降（图3C），呈现毒力与复制能力的权衡效应。
准种竞争实验
荧光标记病毒共感染实验显示，在1:1、1:9和9:1混合比例下，红色荧光标记的T25M突变株在10代内完全取代绿色荧光标记的原始毒株（图7B）。鸡胚传代实验中T25M突变频率从0.11%升至99.96%（图4C），证明该突变在准种竞争中具有绝对选择优势。
讨论
研究首次证实P蛋白25位点苏氨酸向甲硫氨酸的替换（T25M）是NDV毒力进化的关键分子开关。该突变可能通过消除磷酸化位点改变P蛋白构象，增强其与核蛋白（N）、聚合酶（L）的相互作用效率，同时强化对干扰素（IFN）信号通路的抑制功能。连续传代过程中的大种群规模为有害突变清除和有益突变固定提供进化条件，而准种竞争实验则直观展示了适应性突变在病毒群体中的扩散动力学。
结论
鸡胚连续传代驱动NDV弱毒株向中强毒力演化，P蛋白T25M突变是核心遗传决定因子。该突变通过优化病毒复制复合体功能与宿主互作效率，在准种竞争中占据绝对优势。研究为RNA病毒跨种传播和毒力进化机制提供重要理论依据，对疫苗株安全性评估具有警示意义。
