《Nucleic Acids Research》：Unlocking the full potential of nanopore sequencing: tips, tricks, and advanced data analysis techniques
编辑推荐：
本文针对纳米孔测序技术在实验方案和数据分析中存在的挑战，系统评估了300余次测序运行数据，提出了一套完整的优化策略。研究人员通过分析不同样本类型、流动槽版本和实验条件对测序产出的影响，揭示了起始活性孔数对测序产量的关键作用，并验证了流动槽清洗和自适应采样等技术的增效机制。该研究为纳米孔测序的实验设计和数据分析提供了重要指导，显著提升了长读长测序数据的质量和应用价值。
纳米孔测序技术作为基因组学领域的革命性突破，以其长读长、实时测序和便携性等独特优势，正在重塑我们对遗传信息的解读方式。然而，随着该技术的快速发展和广泛应用，研究人员面临着诸多挑战：从样本制备到数据分析的各个环节都存在优化空间，特别是如何平衡测序产量、准确性和成本效益成为亟待解决的问题。此外，针对不同样本类型和实验目的，如何定制化实验方案并建立高效的分析流程，也成为推动该技术进一步应用的关键。
为系统解决这些问题，研究人员开展了大规模的数据驱动研究，通过对300多次纳米孔测序运行的深入分析，涵盖了从病毒到人类的各种样本类型，以及R9和R10两种主流流动槽版本。这项发表在《Nucleic Acids Research》的研究，不仅提供了实用的实验优化策略，还建立了标准化的数据分析框架，为纳米孔测序技术的规范化应用提供了重要参考。
在技术方法方面，研究团队主要运用了以下关键方法：基于Dorado碱基识别和信号处理技术，对原始电流信号进行标准化和分割；采用多变量回归分析评估各因素对测序产量的影响；通过自适应采样技术实现目标区域富集；利用重定相（resquiggling）算法改善信号分割精度；结合人类、小鼠、昆虫等多种生物样本（包括34个直接RNA测序样本）进行验证分析。
测序产量影响因素分析
通过系统评估241个测序运行数据，研究发现测序产量（EB12）主要受起始活性孔数、孔半衰期和样本类型的影响。DNA测序产量显著高于RNA测序，这与RNA较慢的易位速度（约130 nt/秒）和通常较低的起始活性孔数有关。值得注意的是，样本加载量对EB12影响不显著，表明在测序初期，产量主要受活性孔数量限制而非样本可用性。
流动槽性能优化策略
研究证实，流动槽清洗可有效恢复被阻塞的孔道，将活性孔数恢复至清洗前的85.6%。通过对58次清洗操作的分析，发现合理的清洗时机选择（当累积产出曲线趋于平缓时）可最大化测序产出。此外，流动槽年龄（最长249天）对性能无显著影响，这为库存流动槽的合理利用提供了依据。
自适应采样技术的应用效果
在CpG岛富集实验中，通过扩展目标区域两侧的缓冲区域（2000 nt），实现了目标区域测序深度的17倍提升，较全基因组平均深度提高4倍。这种基于实时序列比对的靶向富集技术，为表观基因组学研究提供了高效工具。
核酸修饰检测方法的优化
研究比较了多种修饰检测工具（Nanopolish、Megalodon、Dorado等），发现Dorado在CpG甲基化检测中表现最优。同时，研究还探讨了基于原始信号差异的修饰检测新策略，为170多种已知RNA修饰的高通量筛查提供了可能。
实验方案的实用建议
针对不同应用场景，研究提出了具体建议：为获得长读长，应避免剧烈涡旋，使用切割吸头缓慢移液；对于低输入量样本，可采用载体测序或10x Genomics Chromium Controller技术；在文库制备中，保持接头与样本10:1的比例可确保高效连接。
研究结论强调，纳米孔测序技术的优化需要综合考虑实验设计、硬件性能和数据分析的全流程。通过合理的实验方案定制和数据分析策略选择，可显著提升测序数据的质量和应用价值。该研究建立的标准化框架和实用建议，为纳米孔测序技术在基因组学、表观遗传学等领域的广泛应用奠定了重要基础。
值得注意的是，随着纳米孔技术的持续发展，特别是R10.4.1等新版本流动槽的推出，测序准确性和应用范围将进一步提升。未来研究可在此基础上，进一步探索单分子水平上的核酸修饰检测，以及实时数据分析在临床诊断中的应用潜力。
