虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）是全球水产养殖中最重要的冷水鱼类，尤其在欧洲。伊朗是最大的生产国，其次是欧盟（EU）、土耳其、挪威和智利。2023年，意大利与法国和丹麦共同占据了欧盟虹鳟鱼总产量的大约50%。在欧洲，虹鳟鱼是最有价值的养殖物种，占水产养殖总价值的17.7%（FAO, 2024; FEAP, 2025）。
然而，如今虹鳟鱼养殖场面临着多种细菌性疾病爆发的问题。特别是 Lactococcus garvieae 和 Lactococcus petauri 这些革兰氏阳性细菌，它们会引起乳球菌病，这是一种急性出血性败血症，导致20%至50%的发病率和死亡率（Soltani et al., 2021; Heckman et al., 2024; Vela et al., 2024）。乳球菌病的爆发会导致大量死亡，降低生长速度，增加对其他病原体的易感性，并增加预防/治疗成本（Esposito et al., 2024; Khalil et al., 2024）。尽管另一种 Lactococcus 物种 Lactococcus formosensis 也被确认为病原体，但目前在地中海流域的虹鳟鱼养殖中并不构成威胁（Chan et al., 2024; Heckman et al., 2024）。L. garvieae 影响多种鱼类，被认为是欧洲和美国淡水水产养殖领域的主要细菌病原体之一，尤其是对虹鳟鱼（O. mykiss）养殖的影响尤为显著。最近，乳球菌病也在欧洲海鲈（D. labrax）/金头鲷（S. aurata）养殖场中出现，这一事件被视为该行业的主要卫生紧急情况之一（Salogni et al., 2024; Esposito et al., 2025）。虹鳟鱼、欧洲海鲈和金头鲷的疫情通常发生在春夏季，此时淡水养殖场的水温达到18°C，海水养殖场的水温超过20°C（Khalil et al., 2024）。感染主要通过黏膜发生，L. garvieae 通过血液系统扩散至肾脏、脾脏、肝脏、大脑、鳃等器官，并可扩散到皮肤和鳍部（Bwalya et al., 2021）。无症状鱼可通过粪便排出细菌，健康鱼则可能通过接触水受到感染（Esposito et al., 2024; Khalil et al., 2024）。L. garvieae 和 L. petauri 也被发现可偶尔引起人类感染，表明它们具有动物源性潜力（Mayo-Yá?ez et al., 2023）。
近年来，已开发出多种诊断工具来识别鱼类中的 Lactococcus 物种，包括传统的微生物学技术、快速生化检测（Ortega et al., 2020; Saticioglu et al., 2023）、质谱技术（MALDI-TOF，Heckman et al., 2024）、基因分析（如16S rDNA部分测序）以及分子检测方法（包括终点PCR和定量PCR，单plex或多plex，Shahin et al., 2022; Stoppani et al., 2023; Heckman et al., 2024; Shahin et al., 2025）。
与传统分析方法相比，分子方法具有更高的灵敏度和更低的检测限。此外，它们能够检测到存活但无法培养的细菌中的DNA，甚至死亡生物体中的DNA。由于目标基因在单个细菌中通常存在多个拷贝，因此扩增后灵敏度更高。在分子技术中，终点PCR技术是定性的，灵敏度相对较低，需要使用琼脂糖凝胶电泳来观察扩增产物。实时PCR（定量PCR，qPCR）是一种定量检测方法，具有更高的灵敏度和特异性，可以实时监测扩增过程，但需要制作标准曲线进行绝对定量。在定量PCR技术中，基于探针的方法更为稳健、特异且灵敏度更高（相对于基于SyBr Green的方法），因为它们使用与目标基因高度互补的DNA片段。然而，在目标浓度低或存在反应抑制剂/干扰分子（如环境样本）的情况下，基于SyBr Green的检测方法可能准确性/灵敏度较低（Shahin et al., 2022）。
最近，数字滴液PCR（ddPCR）作为qPCR的一种改进技术出现。数字滴液PCR数据是通过数字机制直接测量的，无需标准曲线（Hindson et al., 2011）。该系统提供负滴液和正滴液的总数，基于泊松分布计算目标DNA的绝对定量（Basu, 2017; Huggett, 2020），从而实现高精度和高灵敏度。研究表明，ddPCR在目标序列拷贝数较低的情况下仍能生成准确结果，并且对PCR抑制剂的敏感性较低（Gutiérrez-Aguirre et al., 2015; Wang et al., 2022; Sumon et al., 2024）。尽管在样本浓度范围较广的情况下可能更倾向于使用qPCR（Zhao et al., 2023），但由于ddPCR具有更高的灵敏度和更高的真阳性检出率，因此更为优越（Chen et al., 2021; Meregildo-Rodriguez et al., 2023）。
如Sumon et al.（2024）所综述的，以往关于ddPCR在鱼类诊断中的应用研究主要集中在病毒性疾病上，例如锦鲤和普通鲤鱼（Cyprinus carpio）的鳃和肾脏中的鲤鱼水肿病毒（Wang et al., 2021）、Oreochromis 和 O. niloticus 组织及环境样本中的罗非鱼湖病毒（Shahi et al., 2023）、地中海养殖的塞内加尔鳎鱼（Solea senegalensis）血液中的神经坏死病毒（Souto et al., 2023），以及Yin et al.（2024）对黄鳍鲷（Acanthopagrus latus）多个器官中的鳞片脱落病病毒的研究。关于细菌的ddPCR应用案例较少，例如在挪威鲑鱼（Salmo salar）养殖系统的水中检测到 Flavobacterium psychrophilum 和 Yersinia ruckeri（Lewin et al., 2020），以及在虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）的脾脏中检测到类似Midichloria的微生物（Oriolis et al., 2022）和帝王鲑（Oncorhynchus tshawytsch）的皮肤中检测到这些微生物（von Ammon 2022），后者还与 Tenacibaculum maritimum 和 Y. ruckeri 共存。不同研究中ddPCR的检测限存在显著差异，这可能与采用的分析方法不同有关，范围通常在0.14至2.25个基因组拷贝/μL之间。
在水产养殖领域，ddPCR可以为快速准确地识别 Lactococcus 病原体带来显著优势。其高灵敏度使得即使在环境样本（如水或沉积物）中细菌浓度极低的情况下也能检测到它们。本研究的目的是开发并验证一种ddPCR方案，用于快速、灵敏且特异性地检测和定量虹鳟鱼及养殖水中的 L. garvieae/petauri DNA。
