脐血NK细胞源胞外囊泡通过ITGB2/穿孔素介导的包膜破坏抑制寨卡病毒感染的机制研究

《Bioactive Materials》：Cord blood natural killer cell-derived extracellular vesicles inhibit Zika virus infectivity through ITGB2/perforin-mediated envelope disruption in vitro and in vivo

本研究针对寨卡病毒(ZIKV)垂直传播引发先天性寨卡综合征(CZS)的临床难题，首次发现脐血自然杀伤细胞源胞外囊泡(CBNK-EVs)通过表面富集的整合素ITGB2与病毒E蛋白结合，借助囊泡内穿孔素破坏病毒包膜，在体外和体内模型中有效抑制ZIKV感染。该研究为开发新型抗病毒纳米疗法提供了理论依据。

　　

当寨卡病毒在2015-2016年间席卷美洲时，它带来的不仅是发热皮疹，更令人震惊的是其对胎儿发育的严重影响——病毒能够穿越胎盘屏障，导致新生儿小头畸形和神经系统损伤，这一系列症状被统称为先天性寨卡综合征。尽管科学家们已经知道寨卡病毒的E蛋白是介导宿主细胞感染的关键，但如何有效阻断病毒垂直传播仍是医学界面临的重大挑战。

在这项发表于《Bioactive Materials》的研究中，南方医科大学第十附属医院的研究团队将目光投向了脐带血中的天然免疫细胞——自然杀伤细胞（NK细胞）。他们发现，这些细胞分泌的纳米级囊泡（CBNK-EVs）可能成为对抗寨卡病毒的新武器。研究人员通过系统的实验证明，这些微小的囊泡不仅能够直接中和病毒，还能穿越胎盘屏障，在动物模型中显著降低胎儿感染率和神经系统损伤。

为了揭示CBNK-EVs的作用机制，研究团队运用了多种关键技术：通过流式细胞术从脐带血中分离纯化CD3^-CD56⁺NK细胞；采用差速超速离心法提取胞外囊泡；利用纳米颗粒追踪分析（NTA）和透射电镜（TEM）对囊泡进行表征；通过蛋白质印迹（Western blot）和ELISA检测囊泡内活性成分；建立干扰素受体缺陷（AG6）小鼠模型评估体内抗病毒效果；运用RNA测序技术分析宿主细胞转录组变化；采用分子对接模拟ITGB2与病毒E蛋白的相互作用。

2.1. CBNK-EVs的特征鉴定

研究人员首先从脐带血中分离出单核细胞，通过流式细胞术纯化得到CD3^-CD56⁺NK细胞。从培养上清中提取的CBNK-EVs经纳米颗粒追踪分析显示其主要分布在200纳米以下，峰值约100纳米。透射电镜确认了囊泡典型的杯状形态，Western blot检测到CD9、CD81、TSG101和ALIX等外泌体标志蛋白的显著富集，而Calnexin未检出，证实了囊泡的高纯度。

2.2. CBNK-EVs的抗ZIKV活性

研究发现CBNK-EVs在Vero-E6和BHK-21细胞中均未表现出细胞毒性。当EV与细胞比例达到1000:1（10⁸-10⁹颗粒/毫升）时，显示出显著的抗病毒效果，且呈剂量依赖性。值得注意的是，CBNK-EVs对登革病毒（DENV）的抑制活性较弱，表明其作用具有ZIKV特异性。

2.3. CBNK-EVs介导ZIKV膜不稳定性

通过设计三种不同的处理方案，研究人员发现病毒预处理组（EVs与ZIKV颗粒先共孵育）的抗病毒效果最为显著，而细胞预处理组无保护作用，说明CBNK-EVs主要通过直接作用于病毒颗粒而非调节宿主细胞来发挥功能。透射电镜观察到CBNK-EVs与ZIKV颗粒之间存在直接结合和膜融合两种相互作用模式。

2.4. CBNK-EVs可穿越胎盘屏障并减少ZIKV垂直传播

活体成像显示，静脉注射的DiD标记CBNK-EVs在4小时后可在小鼠子宫和胎儿组织中检测到显著信号。在IFNAR抗体处理的BALB/c怀孕小鼠模型中，CBNK-EVs预处理显著降低了胎盘和胎儿头部组织中的ZIKV RNA载量，改善了ZIKV引起的胎儿头围减小，并减少了神经细胞感染。

2.5. CBNK-EVs赋予宿主细胞抗ZIKV感染保护

RNA测序分析显示，CBNK-EVs处理显著逆转了ZIKV感染引起的Hippo和PI3K-Akt信号通路异常。时间进程实验表明，仅5分钟的CBNK-EVs与ZIKV预孵育就足以显著降低病毒 infectivity。

2.6. CBNK-EVs抗ZIKV感染的组分和机制

蛋白质组学分析发现CBNK-EVs中富含ITGAX和ITGB2等整合素，以及穿孔素和颗粒酶等NK细胞特征性蛋白。通过siRNA敲低穿孔素表达或使用EGTA螯合Ca²⁺，CBNK-EVs的抗病毒活性显著降低，证实穿孔素是介导病毒包膜破坏的关键效应分子。

2.7. CBNK-EVs在AG6小鼠中的抗ZIKV活性

在IFN受体缺陷的AG6小鼠模型中，CBNK-EVs能够穿越血脑屏障，在海马体等脑区分布。治疗显著改善了感染小鼠的神经行为评分和生存率，降低了各组织中的病毒载量，并减轻了ZIKV引起的神经炎症反应。

研究结论与讨论部分指出，CBNK-EVs通过表面ITGB2与ZIKV E蛋白的特异性结合，使囊泡内穿孔素能够近距离作用于病毒包膜，产生类似病毒进入抑制剂的功效。这种"结合-破坏"的双重机制不仅为理解宿主与病毒相互作用提供了新视角，更重要的是为开发针对先天性寨卡综合征的新型治疗策略奠定了坚实基础。相较于传统中和抗体，CBNK-EVs具有天然穿越生物屏障的优势，且其物理性破坏病毒包膜的机制不易引发病毒逃逸突变。

该研究的创新性在于首次揭示了脐血来源NK细胞胞外囊泡作为天然抗病毒纳米颗粒的生物学功能，并详细阐明了其通过ITGB2/穿孔素轴抑制ZIKV感染的分子机制。这些发现不仅为寨卡病毒感染的防治提供了新思路，也为利用天然纳米颗粒对抗其他包膜病毒开辟了新的研究方向。随着胞外囊泡生产技术的不断优化，CBNK-EVs有望成为临床治疗ZIKV感染，特别是预防垂直传播的有效手段。