《Bioactive Materials》：Integrated cryopreservation-thawing-transplantation platform for neural stem cell-based spinal cord injury repair
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针对脊髓损伤修复缺乏临床有效疗法、传统神经干细胞移植存在细胞存活率低及流程碎片化等问题，天津医科大学总医院团队开发了基于PM-BMH@Exo生物活性材料的集成式冷冻-复苏-移植平台。该平台通过三维微载体保护干细胞活性、外泌体调控免疫微环境，实现了神经干细胞的高效定向分化及运动功能恢复，为脊髓损伤再生医学提供了标准化闭环解决方案。
脊髓损伤后神经功能的不可逆丧失一直是临床治疗的难题。尽管神经干细胞移植被认为是最具潜力的修复策略，但移植后的细胞在炎症微环境中难以存活，且易分化为星形胶质细胞而非神经元。更棘手的是，从细胞冻存、运输到移植的整个流程涉及多次转移操作，导致细胞活性断崖式下降、污染风险增加，严重阻碍了临床转化。
天津医科大学总医院团队在《Bioactive Materials》发表的研究中，构建了一种创新性的集成式冷冻-复苏-移植平台。该平台以聚乳酸多孔微球作为神经干细胞的三维载体，结合负载人脐带间充质干细胞外泌体的仿生基质水凝胶，形成PM-BMH@Exo复合系统。这一设计不仅解决了细胞冻存后的活性维持问题，还能在移植后主动调控损伤区域的免疫反应，为神经再生创造有利条件。
研究团队通过双乳化法制备了孔径均匀的PDLLA多孔微球，其表面经水解改性后亲水性显著提升，便于细胞黏附。仿生基质水凝胶在生理条件下可快速自组装形成三维网络结构，并具备剪切稀化和自愈合特性，适合微创注射。外泌体通过透射电镜和Western blot验证其典型形态及标志蛋白表达。
在机制研究方面，RNA测序显示PM-BMH@Exo复合物通过激活PI3K-Akt和钙信号通路，显著促进神经干细胞向神经元分化，并抑制星形胶质细胞分化。在三维培养体系中，神经干细胞能够在微球间延伸Tuj1阳性神经突，形成跨微球的神经网络结构，同时HIF-1信号通路的上调增强了细胞对缺氧环境的适应性。
动物实验结果表明，移植该复合系统的大鼠在脊髓半切损伤后第56天，损伤区神经元标志物Tuj1和髓鞘碱性蛋白表达显著增加，而胶质瘢痕标志物GFAP下降。MRI及运动诱发电位检测证实损伤空洞缩小、神经传导功能改善。BBB评分和Catwalk步态分析显示治疗组后肢运动功能明显恢复，肌肉萎缩得到缓解。
尤为重要的是，该平台成功克服了细胞冻存运输中的技术瓶颈：经?196°C冻存3个月并模拟运输后，PM@NSC仍保持高活性及干细胞特性，移植后功能恢复效果与新鲜细胞无显著差异。这种“即取即用”的闭环系统为干细胞疗法的标准化临床应用提供了新范式。
主要技术方法
研究采用双乳化法制备PDLLA多孔微球，并通过水解改性增强亲水性；利用透射电镜、纳米颗粒追踪分析等技术表征外泌体；通过RNA测序分析差异表达基因及信号通路；建立大鼠脊髓半切模型，通过免疫荧光、Western blot、MRI、运动诱发电位、BBB评分及Catwalk步态分析等多维度评估修复效果；采用活死染色、CCK-8及流式细胞术评估生物相容性。
研究结果
2.1 仿生基质水凝胶与多孔微球复合物的制备与表征
PDLLA多孔微球具有均匀球形结构（直径270.73±47.69 μm）和互联孔道（孔径26.11±5.82 μm），水解后接触角从117.35°降至68.5°，亲水性显著提升。仿生基质水凝胶在生理条件下5分钟内自组装成孔状网络结构，1.5 wt%浓度下存储模量达404 Pa，可通过25G注射器顺利注射。微球与水凝胶以10:1质量比复合后形成均匀三维支架。
2.2 复合物的生物相容性与降解性
活死染色显示PM-BMH@Exo复合物对神经干细胞无毒性，且外泌体组分显著促进细胞增殖。皮下植入实验表明微球3周内完全降解，主要器官组织学及血液生化指标未发现异常，证实系统具有良好的生物安全性。
2.3 复合物诱导神经干细胞向神经元分化的机制
Transwell共培养实验显示，PM-BMH@Exo处理组神经干细胞Tuj1表达上调而GFAP下调，Western blot验证神经元分化关键蛋白表达增加。RNA测序发现该复合物通过激活钙信号通路和PI3K-Akt通路促进神经发生，且突触相关基因显著富集。
2.4 PDLLA多孔微球三维培养系统的特性
三维培养中神经干细胞沿微球表面及内部孔道扩展，形成跨微球连接的神经网络。转录组分析显示三维微环境激活HIF-1信号通路及血管生成相关基因，增强细胞抗逆性。
2.5 BMH@Exo重编程炎症微环境
在LPS诱导的炎症模型中，BMH@Exo显著降低M1型巨噬细胞标志物iNOS表达，提升M2型标志物Arg1表达，并抑制促炎因子TNF-α和IL-1β释放。脊髓损伤大鼠模型中，该复合物有效减少CD68阳性炎症细胞浸润，改善局部免疫状态。
2.6 复合移植系统促进神经发生与轴突再生
移植56天后，BMH@Exo-PM@NSC组损伤区神经元数量、髓鞘密度及突触蛋白表达均显著高于对照组，组织空洞体积明显缩小。
2.7 复合系统促进运动功能恢复
治疗组大鼠BBB评分、步态协调性及肌力均显著改善，运动诱发电位潜伏期缩短、波幅恢复，证实神经通路功能重建。
2.8 CTT平台克服冻存运输瓶颈
冻存3个月的PM@NSC复苏后细胞活性、干细胞标志物表达及抗凋亡能力与新鲜细胞无差异，移植后修复效果一致，实现“off-the-shelf”应用。
结论与讨论
该研究通过材料学与细胞生物学手段的深度融合，构建了一种能够整合细胞保存、运输及移植全流程的创新型平台。其核心优势在于：通过三维微载体物理保护与外泌体生物调控的双重作用，突破传统干细胞移植中细胞存活率低、分化方向不可控及流程标准化难三大瓶颈。该平台不仅为脊髓损伤修复提供了一种高效、可控的治疗策略，也为其他干细胞依赖型疾病的临床转化建立了技术范本。未来研究需进一步明确移植细胞与宿主神经环路的整合机制，并在大型动物模型中验证其长期安全性及疗效。
