《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Hyperbaric oxygen improves combined drug-induced hyperuricemia model in rats by remodeling gut microbiota and regulating host metabolism
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本研究针对高尿酸血症（HUA）现有药物治疗副作用大、临床需求迫切的问题，探讨了高压氧（HBO）疗法对复合药物（酵母、氧嗪酸钾和次黄嘌呤）诱导的大鼠HUA模型的改善作用及机制。研究发现HBO能显著降低模型大鼠血清尿酸（UA）、肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平，减轻肾脏和小肠组织病理损伤，并通过16?S rRNA测序和血清非靶向代谢组学分析揭示其作用与重塑肠道菌群（如降低拟杆菌属和另枝菌属相对丰度）以及调节谷胱甘肽代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢等关键代谢通路有关。该研究为HUA的非药物治疗提供了新的实验证据和潜在靶点。
随着生活水平的提高和饮食结构的改变，高尿酸血症（Hyperuricemia, HUA）的发病率在全球范围内呈现显著上升趋势，已成为威胁人类健康的常见代谢性疾病。高尿酸血症是指血液中尿酸（Uric Acid, UA）水平异常升高，其发生主要与尿酸生成过多或排泄减少有关。长期的高尿酸血症可导致一系列严重的并发症，如痛风性关节炎、肾脏损伤、心血管疾病等，对机体多器官系统造成不可逆的损害。目前高尿酸血症的治疗方法主要包括生活方式干预和药物治疗。生活方式干预主要涉及饮食管理、规律运动、戒烟戒酒、避免诱因等。治疗高尿酸血症的药物主要包括抑制尿酸生成的药物，如别嘌呤醇、非布司他等；以及促进尿酸排泄的药物，如苯溴马隆等。然而，这些药物在长期使用过程中可能引起胃肠道反应、肝肾功能损伤等不同程度的副作用，限制了其临床应用。因此，寻找安全有效的预防或治疗高尿酸血症的方法是当前研究的主要目的。
近年来，高压氧（Hyperbaric Oxygen, HBO）疗法作为一种新兴的治疗方式，在多种疾病的治疗中展现出独特优势。高压氧疗法是让患者在高于标准大气压的环境下吸入纯氧，从而提高血液和组织中的氧含量，改善组织缺氧状态，调节机体生理功能。研究发现，高压氧疗法对代谢性疾病具有一定的治疗潜力，其可能通过调节机体代谢过程、改善氧化应激状态、调节免疫系统等多种途径发挥作用。然而，关于高压氧疗法能否降低体内尿酸含量，目前国际社会尚无相关报道，国内仅有关于高压氧疗法对高原地区高尿酸血症治疗效果的观察。因此，本研究以高压氧治疗高尿酸血症为切入点，旨在探索其治疗效果及潜在机制。
代谢组学（Metabolomics）作为一门新兴学科，能够全面、系统地分析体内所有代谢产物的变化，为了解疾病发病机制及治疗效果提供了有力工具。通过代谢组学分析，可以揭示高压氧疗法对高尿酸血症动物体内代谢物的影响，发现潜在的生物标志物和治疗靶点。此外，肠道菌群（Gut Microbiota）作为机体的“第二基因组”，在维持机体健康和代谢平衡中起着至关重要的作用。粪便中的16?S rRNA（16S ribosomal RNA）测序技术能够精准分析肠道菌群群落的组成和结构变化。越来越多的研究表明，肠道菌群失调与高尿酸血症的发生发展密切相关。高压氧疗法能否通过调节肠道菌群的结构和功能来改善高尿酸血症动物的状况，值得深入探索。
本研究旨在探讨高压氧疗法对动物高尿酸血症的治疗效果及其潜在机制。通过血清代谢组学和粪便16?S rRNA测序技术，分析高尿酸血症动物经高压氧治疗后代谢组和肠道菌群群落的变化，为高压氧治疗高尿酸血症提供理论依据和新的治疗思路。相关研究成果发表在《Biochemical and Biophysical Research Communications》期刊上。
为开展本研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，采用复合药物（含30%酵母的饲料联合氧嗪酸钾和次黄嘌呤灌胃）诱导建立SD大鼠高尿酸血症模型。其次，使用小型动物高压氧舱对模型大鼠进行高压氧干预治疗。在实验终点，收集大鼠血清、粪便以及肾脏和小肠组织样本。随后，利用生化试剂盒检测血清尿酸、肌酐和尿素氮水平；通过苏木精-伊红（HE）染色评估肾脏和小肠组织的病理形态学变化；采用16?S rRNA基因测序技术分析肠道菌群的结构组成变化；并运用基于超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）的非靶向代谢组学技术分析血清代谢谱的变化。最后，对菌群数据和代谢组学数据进行整合关联分析，以揭示其内在联系。
3.1. HBO疗法对HUA模型大鼠体重、肾功能及肾脏和小肠组织病理结构的影响
研究人员在实验开始前（基线）、实验第3天和第6天分别测量了各组大鼠的体重。结果显示，与正常对照组相比，高尿酸血症组和高压氧治疗组大鼠的体重在实验第3天和第6天均显著降低，且两组动物的体重变化趋势一致，表明造模过程对大鼠体重产生了影响。在肾功能指标方面，与正常对照组相比，高尿酸血症组和高压氧治疗组大鼠的血清尿酸、肌酐和尿素氮水平均显著升高；然而，与高尿酸血症组相比，高压氧治疗组大鼠的这三项指标均显著降低，说明高压氧治疗有效改善了大鼠的肾功能。
通过对肾脏和小肠组织进行HE染色观察病理结构变化发现，正常对照组大鼠肾脏组织结构清晰，肾小球和肾小管结构完整；而高尿酸血症组大鼠肾脏出现肾小球体积偶见变小、系膜增生、大量肾小管管腔扩张、肾小管上皮细胞变平等病理损伤，肾间质可见少量淋巴细胞浸润。小肠组织方面，高尿酸血症组大鼠局部肠上皮脱落，绒毛显著减少、断裂，肠绒毛变短，肠黏膜上皮细胞出现不同程度损伤。经过高压氧治疗后，上述肾脏和小肠组织的病理变化均得到显著缓解。进一步的形态计量学分析显示，高压氧治疗显著增加了高尿酸血症模型大鼠小肠绒毛的高度，降低了隐窝的深度，并改善了肠壁肌肉层的厚度，表明高压氧对肠道黏膜屏障具有保护作用。
3.2. 各组大鼠粪便16?S rRNA基因测序分析结果
通过对大鼠粪便进行16?S rRNA基因测序分析，韦恩图显示三组样本共检测到7499个扩增子序列变异（ASVs），其中三组共有的ASVs为465个。主坐标分析（PCoA）结果表明，正常对照组和高尿酸血症组大鼠的肠道菌群群落结构存在明显距离，表明高尿酸血症大鼠的肠道菌群结构发生了显著改变。而高压氧治疗组与高尿酸血症组的菌群存在一定程度的分散，提示高压氧治疗能够调节高尿酸血症大鼠的肠道菌群结构。
在门水平上，三组样本中厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）是主要的菌门，其相对丰度之和在各组样本中均超过90%。与正常对照组相比，高尿酸血症组和高压氧治疗组大鼠肠道中厚壁菌门的相对丰度值显著降低，而拟杆菌门的相对丰度值显著升高。在属水平上，拟杆菌属（Bacteroides）和另枝菌属（Alistipes）是三组样本中的优势菌属。与正常对照组相比，高尿酸血症组和高压氧治疗组大鼠肠道中拟杆菌属和另枝菌属的相对丰度值均显著升高；但与高尿酸血症组相比，高压氧治疗组大鼠肠道中这两种菌属的相对丰度值则显著降低。这些结果表明，高压氧治疗能够调节高尿酸血症引起的肠道菌群失衡，特别是降低了潜在致病菌拟杆菌属和另枝菌属的相对丰度。
3.3. 各组大鼠的代谢组学差异
对各组大鼠血清进行非靶向代谢组学分析，共鉴定出1865种代谢物。主成分分析（PCA）得分图显示组间存在显著差异。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型验证表明模型预测能力强，组间分离完全。火山图显示了各组间显著上调和下调的前10种代谢物质。热图结果显示，正常对照组与高尿酸血症组之间的代谢物组成存在显著差异，表明高尿酸血症大鼠的代谢模式发生了显著改变。而高压氧治疗组部分差异代谢物的变化趋势趋于正常对照组。
KEGG通路富集分析表明，高尿酸血症模型大鼠的差异代谢通路主要富集在氨基酸代谢（如甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸代谢）、氰胺氨基酸代谢等方面。而高压氧治疗后的代谢通路富集则主要表现于谷胱甘肽代谢（Glutathione metabolism）以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢（D-glutamine and D-glutamate metabolism）等通路。这提示高压氧治疗可能通过调节机体的抗氧化防御系统和氨基酸代谢来发挥降低尿酸的作用。
3.4. 血清代谢组与肠道菌群的相关性分析
为了探索不同血清代谢物与不同物种丰度之间的潜在关系，研究人员进行了Spearman相关性分析。结果显示，与高尿酸血症组相比，正常对照组中有22种代谢物与未分类的梭菌目（Clostridiales_unclassified）相关，12种代谢物与拟杆菌属相关，38种代谢物均与臭杆菌属（Odoribacter）相关，33种代谢物均与弯曲杆菌门（Campylobacterota）相关。其中有18种肠道菌群与尿酸相关，其中13种呈负相关，5种呈正相关。
在高尿酸血症模型组与高压氧治疗组的比较中，发现有15种代谢物与疣微菌门（Verrucomicrobiota）和阿克曼菌属（Akkermansia）相关。疣微菌门与15S-氢过氧-11Z,13E-二十碳二烯酸（15S-Hydroperoxy-11Z,13E-eicosadienoic acid）呈显著正相关，而与4-甲酚硫酸酯（4-Cresol sulfate）、羟基苯乙酰甘氨酸（Hydroxyphenylacetylglycine）和3-羟基扁桃酸（3-Hydroxymandelic acid）呈显著负相关。阿克曼菌属与15S-氢过氧-11Z,13E-二十碳二烯酸呈显著正相关，而与4-甲酚硫酸酯、四氢嘧啶（Ectoine）和羟基苯乙酰甘氨酸呈显著负相关。其中相关性最显著的代谢物是15S-氢过氧-11Z,13E-二十碳二烯酸和4-甲酚硫酸酯。这些发现表明肠道菌群与血清代谢物之间存在着复杂的相互作用。
4. 讨论
本研究通过联合使用酵母、氧嗪酸钾和次黄嘌呤成功建立了大鼠高尿酸血症模型。研究发现，高压氧治疗能显著降低高尿酸血症大鼠的尿酸、肌酐和尿素氮水平，并减轻肾脏和小肠组织的病理损伤。基础研究报告表明，高压氧治疗能够减轻多种因素引起的肾脏损伤，少数临床研究也报道高压氧疗法可以降低高尿酸血症患者的尿酸水平。为阐明机制，研究人员进行了血清代谢组和肠道微生物组的分析。
高尿酸血症的发病机制涉及多种机制，其中之一是肠道菌群失调。本研究发现，与正常大鼠相比，高尿酸血症大鼠肠道菌群的主要变化在门水平上表现为厚壁菌门的相对丰度显著降低，而拟杆菌门的相对丰度显著升高；在属水平上，拟杆菌属和另枝菌属的相对丰度显著升高。这与先前的研究结果一致。高压氧治疗改善了大鼠的肠道菌群，在属水平上显著降低了拟杆菌属和另枝菌属的相对丰度。厚壁菌门通常被视为抗炎细菌，而厚壁菌门/拟杆菌门比值的失衡可能与肥胖、糖尿病等代谢综合征相关。拟杆菌属通常与慢性肠道炎症相关，另枝菌属是拟杆菌门的一个属，其对丙氨酸和尿酸的循环水平有正向贡献。研究发现，另枝菌属相对丰度的增加可能通过调节嘌呤代谢加剧痛风症状。高压氧疗法通过降低拟杆菌属和另枝菌属的相对丰度，减少了潜在致病菌，降低了内源性尿酸的产生，可能是通过调节肠道菌群来缓解高尿酸血症。
对各组大鼠血清进行的代谢组学分析发现，高尿酸血症大鼠模型成功建立后，通路主要富集于甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸代谢以及氰胺氨基酸代谢；高压氧治疗后，通路主要富集于谷胱甘肽代谢以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢。甘氨酸是一种非必需氨基酸，是体内最简单的氨基酸。研究表明，甘氨酸可用于合成谷胱甘肽、血红蛋白、肌酸、核酸和尿酸，并主要参与嘌呤和嘧啶的合成。甘氨酸是体内苏氨酸和丝氨酸代谢的产物，苏氨酸通过苏氨酸脱氢酶和苏氨酸醛缩酶降解为甘氨酸。丝氨酸是一种非必需氨基酸，在丝氨酸羟甲基转移酶存在下可转化为甘氨酸，而甘氨酸是氨转化为尿酸的必需原料。先前有研究发现高尿酸血症痛风患者体内苏氨酸、胆碱、丝氨酸和甘氨酸水平升高，提示苏氨酸、丝氨酸和甘氨酸代谢异常可能与炎症刺激、机体功能障碍和代偿效应有关，代偿效应增强了甘氨酸的抗炎反应。氰胺氨基酸代谢是指涉及含氰基团氨基酸的合成、降解和利用的生化过程。本研究中氰胺氨基酸代谢过程的差异表达可能与氮含量的差异有关。
谷胱甘肽是细胞中关键的抗氧化剂，具有抗氧化防御和解毒功能。研究表明，尿酸的积累和谷胱甘肽的失衡与器官损伤的发病机制有关。有报道称，敌敌畏会抑制谷胱甘肽过氧化物酶和其他抗氧化活性，而这些抗氧化剂对维持谷胱甘肽抗氧化系统具有保护作用，这是由于尿酸在肝肾组织中积累引起的过度氧化应激所致。这种氧化还原失衡导致肝肾组织学检查中出现细胞结构紊乱和细胞变性。因此，研究人员推测高压氧疗法通过增强谷胱甘肽抗氧化防御系统，实现降低高尿酸血症大鼠尿酸含量以及对肾脏和小肠的病理损伤。研究团队先前关于高压氧对脑保护作用的研究主要与抵抗氧化应激和增强抗氧化系统有关，这与本研究结果一致。另有研究报道，在高尿酸血症肾病进展的文章中，高尿酸血症模型小鼠表现出肾脏损伤，尿酸、肌酐和尿素氮水平升高，铁沉积增加以及谷胱甘肽过氧化物酶4表达下降，这也与本研究推测相符。
D-谷氨酰胺是谷氨酰胺的光学异构体。有研究报道，谷氨酰胺治疗可以降低肠缺血再灌注损伤后尿酸的升高，而升高的尿酸水平会引发氧化应激和细胞损伤。尿酸被认为是氧化应激的诱导剂。这也与研究人员先前的推测一致，即高压氧疗法可通过改善氧化应激来降低尿酸水平。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中最重要的兴奋性氨基酸之一，其摄取受谷氨酰胺合成酶的激活或表达影响。本研究中，高压氧治疗后高尿酸血症模型大鼠血清中的主要代谢通路主要富集于谷胱甘肽代谢以及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢。研究人员推测高压氧疗法可能通过调节这些代谢通路来降低机体氧化应激，从而降低尿酸水平。
肠道菌群对宿主代谢有显著影响。菌群与宿主共生关系的失衡通常与微生物群失调有关。因此，研究人员从宿主血清代谢与肠道细菌关系的角度探讨了高压氧疗法在高尿酸血症疾病中的作用。他们对本实验获得的21种与高尿酸血症和高压氧相关的代谢物，以及在门和属水平上表现出显著变化的22种肠道细菌的丰度进行了相关性分析。实验结果揭示，有15种代谢物与疣微菌门相关，15种代谢物与阿克曼菌属相关。疣微菌门与15S-氢过氧-11Z,13E-二十碳二烯酸呈显著正相关，而与4-甲酚硫酸酯、羟基苯乙酰甘氨酸和3-羟基扁桃酸呈负相关。阿克曼菌属与15S-氢过氧-11Z,13E-二十碳二烯酸呈显著正相关，而与4-甲酚硫酸酯、四氢嘧啶和羟基苯乙酰甘氨酸呈负相关。疣微菌门是一种革兰氏阴性菌，广泛存在于环境中，是健康个体肠道微生物群中第三大丰富的微生物群。目前关于疣微菌门的许多研究都与肿瘤发展有关。有报道称疣微菌门与降低心脏肿瘤风险相关。阿克曼菌属在维持肠道屏障完整性方面发挥作用，其肠道含量随年龄变化。研究表明高脂饮食会降低肠道微生物群中疣微菌门和阿克曼菌属的含量。阿克曼菌属与低度炎症引起的肠道通透性异常有关，被认为是肠道中第二类有益细菌。
15S-氢过氧-11Z,13E-二十碳二烯酸是一种单氢过氧化物多不饱和脂肪酸，与此代谢物相关的研究报道较少。4-甲酚硫酸酯也称为对甲酚硫酸酯，是酪氨酸和苯丙氨酸在肝脏中的代谢产物，存在于慢性肾病患者的血液中。有研究通过对3641名参与者的血浆4-甲酚硫酸酯浓度进行分析，以阐明4-甲酚硫酸酯对四种慢性疾病的影响，结果证实了慢性肾病患者4-甲酚硫酸酯水平的升高，并发现代谢综合征患者4-甲酚硫酸酯水平呈下降趋势。该研究还发现4-甲酚硫酸酯与血压调节、肝肾功能、血液学、睡眠质量、眼内压、离子调节、酮体和脂肪酸代谢、疾病史和饮食习惯等39种表型相关。其中19种完全表型显著特征与代谢综合征相关，提示4-甲酚硫酸酯可能是代谢综合征的潜在生物标志物。羟基苯乙酰甘氨酸是一种芳香族甘氨酸，可通过酪胺代谢过程产生。酪氨酸是酪胺的直接前体，酪氨酸经过脱羧反应形成酪胺。因此，羟基苯乙酰甘氨酸的代谢异常与酪氨酸代谢紊乱有关，这可导致线粒体脂肪酸氧化障碍并进一步损害肾脏。在先前的一项研究中发现，尿中3-羟基扁桃酸的排泄量与酪氨酸的摄入量有关。因此，羟基苯乙酰甘氨酸和3-羟基扁桃酸都与体内酪氨酸代谢有关。总体而言，疣微菌门和阿克曼菌属与脂肪酸的相关代谢呈正相关，但与酪氨酸代谢呈负相关。本研究发现高压氧治疗后，疣微菌门和阿克曼菌属与4-甲酚硫酸酯呈最显著的负相关，而与15S-氢过氧-11Z,13E-二十碳二烯酸呈最显著的正相关。
5. 结论
高压氧疗法通过降低血清尿酸、肌酐和尿素氮水平，以及减轻肾脏和小肠组织的病理损伤，对高尿酸血症发挥保护作用。同时，血清代谢组学和肠道微生物组分析表明，高压氧治疗具有恢复肠道菌群平衡和纠正代谢紊乱的潜力。具体而言，在本研究的高尿酸血症模型大鼠中，对粪便和血清样本的观察显示，高压氧疗法减弱了高尿酸血症组拟杆菌属和另枝菌属相对丰度的升高；它还逆转了高尿酸血症引起的部分差异血清代谢物的改变。此外，相关性分析表明高压氧疗法主要调节某些脂肪酸和酪氨酸的代谢，从而鉴定出两种关键代谢物，即15S-氢过氧-11Z,13E-二十碳二烯酸和4-甲酚硫酸酯。需要指出的是，高压氧干预后观察到的肠道菌群和代谢谱的变化可能代表相关性而非因果关系。在后续研究中，将对特定的肠道菌群和代谢物进行靶向干预，以阐明代谢物与肠道菌群之间的相互作用机制，从而验证高压氧抗高尿酸血症的潜在治疗机制。
