从人类羊水中提取的、富含miR-29的细胞外囊泡能够改善子宫内膜纤维化，并促进子宫粘连实验模型中受损子宫内膜的修复

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Human amniotic fluidic derived-extracellular vesicles enriched by miR-29 ameliorate endometrial fibrosis and promote repair of damaged endometrium in an experimental model of intrauterine adhesion

hAF-EVs通过抑制TGF-β/SMAD3信号通路减轻小鼠子宫粘连纤维化，改善子宫内膜再生和生育能力，miR-29富集后效果更显著。

阿什坎·拉苏利-萨拉瓦尼（Ashkan Rasouli-Saravani）|侯赛因·甘巴里安（Hossein Ghanbarian）|法希梅·拉梅扎尼-泰赫拉尼（Fahimeh Ramezani-Tehrani）|纳里曼·莫萨法（Nariman Mosaffa）|萨哈尔·加法里-卡利格（Sahar Ghaffari-Khaligh）|尼基·甘巴里-穆罕默迪（Niki Ghambari-Mohammadi）|基米亚·拉希丹（Kimia Rashidan）|阿米尔穆罕默德·穆罕默迪阿拉（Amirmohammad Mohammadiara）|玛拉克西玛·阿亚迪洛德（Malaksima Ayadilord）|赛义德·马哈茂德·哈希米（Seyed Mahmoud Hashemi）

伊朗德黑兰沙希德·贝赫什蒂医科大学（Shahid Beheshti University of Medical Sciences）医学院免疫学系

摘要

背景

宫内粘连（Intrauterine Adhesions, IUA）是由于过度纤维化重塑、子宫内膜再生失败以及生育能力受损所引起的，目前尚无有效的治疗手段。人羊水来源的细胞外囊泡（Human Amniotic Fluid-derived Extracellular Vesicles, hAF-EVs）具有天然的再生潜力，是靶向递送抗纤维化microRNA（如miR-29）的有前景的平台。

方法

通过机械损伤子宫内膜建立了小鼠宫内粘连模型。将未经修饰的hAF来源的EVs或富集miR-29的hAF-EVs施用于小鼠。使用组织学和免疫组化方法、定量PCR以及生育能力测试来评估子宫内膜再生、纤维化、血管生成以及分子纤维化标志物的表达情况。

结果

与未经处理的宫内粘连对照组相比，hAF-EVs和富集miR-29的hAF-EVs均显著改善了子宫内膜结构，减少了胶原沉积，并提高了生育能力。虽然未经修饰的EVs表现出较强的再生和抗纤维化效果，但富集miR-29的EVs更能有效抑制TGF-β/SMAD3相关的纤维化信号通路，促进血管生成，并在选择性改善着床相关参数方面表现更佳。多项组织学结果显示，两种EV处理组之间存在相似的恢复情况。

结论

hAF来源的EVs是一种有效的无细胞治疗策略，可用于减轻宫内粘连后的纤维化并促进子宫内膜修复。富集miR-29可进一步增强分子和功能效果，这支持了其在基于EV的再生平台中的靶向调节作用。

引言

复发性流产在女性中的发生率为约5%，通常需要进行扩张清宫术（D&C），这会导致15-20%的女性出现宫内粘连（IUAs）[1, 2, 3]。产后清宫后，这种状况的患病率在21%至40%之间[4]。宫内粘连的特点是子宫腔内形成纤维化瘢痕组织，可能导致不孕、反复流产以及月经异常，如月经量减少或闭经[5]。这种病理状况通常被称为阿谢曼综合征（Asherman Syndrome），是由于子宫内膜基底层的损伤引起的，可能与创伤、感染或手术干预（如清宫术和产后出血治疗）有关[6, 7]。尽管目前采用现代治疗方法（如宫腔镜粘连松解术、宫内节育器IUD和雌激素）对宫内粘连进行常规临床管理，但中度和重度宫内粘连仍具有较高的复发率（33.3%至62.5%）和较差的妊娠结局（23.7%至27.7%）[8, 9, 10, 11, 12, 13]。这些问题凸显了迫切需要新的治疗方案来减少纤维化进程并促进子宫内膜成功再生。

宫内粘连的病理特征是异常的细胞外基质（ECM）沉积，这主要是由多种机制促成的，例如转化生长因子-β1（TGF-β1）的增加[14]。这种细胞因子会激活SMAD2/3通路，进而引发多种促纤维化蛋白基因的表达，包括I型胶原α-1链蛋白（COL1A1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和上皮-间充质转化（EMT）[14, 15, 16]。羊水膜（Amniotic Fluid Membrane, AFM）或人羊水（hAF）是抗纤维化细胞因子和生长因子的异质来源[17]。研究表明，hAF中的间充质干细胞（基质细胞）和上皮细胞具有抗纤维化作用，而保存完好的hAF在体外也显示出抗纤维化效果[18]。此外，hAF条件培养基已被证明能抑制人类肺成纤维细胞的纤维化，表明hAF会释放抗纤维化因子[19]。此外，不同组织分泌的细胞外囊泡（EVs）作为无细胞治疗工具具有抗纤维化潜力，并可作为有效载体递送非编码RNA（尤其是microRNAs，miRs）[20, 21]。例如，miR-455-5p已被发现是一种具有直接靶向组织能力的抗纤维化miRNA[22]。总体而言，microRNAs通过抑制翻译或促进特定信使RNA（mRNAs）的降解来调节生物功能[23]。高水平的miR-195与瘢痕形成和发展有关，这是宫内粘连发病机制中的关键过程之一[24]。另一方面，多种miRNAs（如miR-340、miR-1291、miR-466、miR-122、miR-455、miR-543和miR-326）也被报道可通过多种机制抑制纤维化并改善宫内粘连[22, 25, 26, 27, 28, 29]。李等人还发现，miR-29表达的减少也是宫内粘连形成和进展的因素之一[30, 31]。

miR-29是一种重要的调节因子，具有强大的抗纤维化作用，在宫内粘连中其表达受到显著抑制[30, 31, 32]。miR-29能够调节ECM的产生、细胞增殖并在大多数病理条件下诱导细胞凋亡[33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41]。像TGF-β/SMAD3信号通路这样的促纤维化过程常常导致miR-29表达下调，从而在心脏、肾脏和肺部纤维化以及系统性硬化等疾病中发挥作用，导致胶原和细胞外基质的过度产生[33, 34, 35, 36]。miR-29疗法已被证明可以防止成纤维细胞活化，减少ECM沉积并诱导细胞凋亡，因此是一种潜在的纤维化治疗剂[33, 34, 35, 36, 37, 38]。此外，miR-29还调节多种分子通路，如TGF-β/SMAD、PI3K/Akt和Wnt/b-catenin，并与其他关键的组织重塑和纤维化相关表观遗传调节因子相互作用，包括FOS和DNMT3b[38, 42]。miR-29在肿瘤学中的作用非常复杂，它既具有抗肿瘤活性（通过调控癌相关成纤维细胞的活性），又在某些恶性肿瘤中具有促肿瘤活性（例如乳腺癌），高水平的miR-29与肿瘤迁移和侵袭有关，这是通过下调肿瘤抑制基因PTEN实现的[39, 40, 41]。此外，miR-29还与非编码RNA（如circHIPK3、lncRNA XIST）相互作用，进一步丰富了其调控网络，影响纤维化和伤口愈合[33, 43]。综上所述，miR-29在纤维化和肿瘤疾病过程中都起着关键作用，为生物标志物和治疗方法的选择提供了丰富的潜力。特别是，miR-29能抑制胶原和其他ECM成分的产生，从而防止TGF-β1介导的纤维化效应[44]。研究表明，miR-29在抑制宫内粘连的纤维化中起关键作用。对原代人子宫内膜基质细胞的体外实验表明，miR-29b能抑制TGF-β1诱导的纤维化标志物和信号通路，减少纤维化的发展[32]。在宫内粘连的小鼠模型中进行的体内实验表明，miR-29b过表达或通过骨髓间充质干细胞递送外泌体可以抑制或缓解子宫内膜纤维化，修复受损组织，并抑制主要的纤维化通路和上皮-间充质转化[30, 31]。然而，人羊水来源的细胞外囊泡（hAF-EVs）和富集miR-29的hAF-EVs在宫内粘连中的治疗潜力仍不明确。

在本研究中，我们提出了一种新的非侵入性治疗方法，利用载有miR-29的hAF-EVs来对抗宫内粘连的纤维化。该方法旨在将miR-29定位于子宫内，以防止异常胶原沉积，减少纤维化重塑，并提高子宫内膜的接受性。此外，我们还将研究hAF-EVs递送miR-29是否能够下调α-SMA和COL1A1等纤维化特异性标志物以及TGF-β和SMAD3等纤维化信号通路标志物，从而在宫内粘连的小鼠模型中改善组织学和生育结果。这种方法克服了现有方法的局限性，提供了一种靶向的无细胞抗纤维化疗法，能够在宫内粘连发展的早期阶段发挥作用。如果成功，该方法将显著提高妊娠率并降低粘连复发率，从而大大推进生殖道纤维化的治疗。

样本收集和伦理考虑

羊水样本来自妊娠36至37周进行选择性剖宫产的女性。样本由妇产科医生采集，医生切开子宫并暴露羊水膜，在膜上做一个小孔，确保在胎儿之外采集样本。在获得部分孕妇的书面同意后，采集了羊水样本。本研究已获得批准。

人羊水来源的EVs特征分析

我们使用FESEM和AFM观察分离出的EVs的形态。这些EVs呈典型的圆盘状，位于脂质双层内，尺寸介于30至200纳米之间（图3A和3D）。Western blot分析确认了EVs含有典型的EV标志物，包括CD9、CD63和CD81，而calnexin未在这些囊泡中检测到（图3B）。DLS分析显示hAF-EVs的平均大小约为95.7纳米（图3C）。定量RT-PCR显示miR-29...

讨论

在本研究中，我们检测了未经修饰或富集miR-29的hAF-EVs在宫内粘连小鼠模型中的治疗潜力。结果表明，基于hAF-EVs的疗法能有效促进子宫内膜愈合，减轻瘢痕组织形成，并在子宫损伤后改善生育能力。重要的是，尽管两种EV配方都取得了积极的结果，但富集miR-29进一步增强了某些分子、血管生成和生殖方面的指标。

结论

研究表明，人羊水来源的细胞外囊泡可以促进子宫内膜愈合，防止纤维化瘢痕形成，并提高宫内粘连小鼠模型的生殖成功率。未经修饰的hAF-EVs本身具有重要的再生和抗纤维化特性，而添加miR-29后则进一步增强了特定的分子、血管生成和生育相关效果。这些发现使hAF-EVs成为一种有前景的无细胞治疗平台，而miR-29...

作者贡献声明

赛义德·马哈茂德·哈希米（Seyed Mahmoud Hashemi）：撰写、审稿与编辑、可视化、验证、监督、资源管理、方法学设计、资金获取、概念构思。玛拉克西玛·阿亚迪洛德（Malaksima Ayadilord）：方法学设计、实验实施。阿米尔穆罕默德·穆罕默迪阿拉（Amirmohammad Mohammadiara）：方法学设计、实验实施。基米亚·拉希丹（Kimia Rashidan）：方法学设计、实验实施。尼基·甘巴里·穆罕默迪（Niki Ghambari Mohammadi）：方法学设计、实验实施、数据分析。萨哈尔·加法里-卡利格（Sahar Ghaffari Khaligh）：验证、方法学设计、数据分析。纳里曼·莫萨法（Nariman Mosaffa）：

伦理批准

本研究遵循了伊朗德黑兰沙希德·贝赫什蒂医科大学伦理委员会（Ethical Code: IR.SBMU.MSP.REC.1400.831）的指导和规定。

数据可用性

本研究生成或分析的所有数据均包含在发表的文章中。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

人工智能和AI辅助技术在写作过程中的使用

在准备本论文的过程中，作者使用了QuillBot工具辅助改写和优化语言。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审阅和编辑，并对出版物的内容负全责。

资金支持

本文摘自我在沙希德·贝赫什蒂医科大学医学院的论文（注册号：43007375）。本研究得到了沙希德·贝赫什蒂医科大学的资助（资助编号：43008530）。

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文工作的已知财务利益或个人关系。

致谢

不适用。