一种协同策略，结合反向适应技术和工程改造的间充质干细胞外泌体，用于对抗骨关节炎中的铁死亡（ferroptosis）

《Biomaterials》：A synergistic strategy involving reverse-adaptation and engineered MSC exosomes against ferroptosis in osteoarthritis

骨关节炎进展受氧化应激和ferroptosis驱动，本研究通过反向适应策略预处理间充质干细胞，发现miR-142a-3p可靶向GSK3β/Nrf2/SLC7A11轴抑制ferroptosis和ROS积累。工程化miR-142a-3p递送的外泌体（EXOmiR-142a-3p）结合可降解、软骨靶向微球平台，显著延缓DMM诱导的OA进展，改善软骨基质降解，验证了环境适配型外泌体疗法的潜力。

　　

王金武|楼超|沈志豪|杨金|江宏伟|于恒|张宇|李阳波|陈华|吴爱民|张增杰|蔡蕾怡|郑文豪

温州医科大学第二附属医院及玉英儿童医院骨科，中国温州325000

摘要

骨关节炎（OA）的进展是由持续的氧化应激和铁死亡（ferroptosis）驱动的，这两种因素会侵蚀软骨细胞的活力和细胞外基质的完整性。尽管间充质干细胞衍生的外泌体（MSC-EXO）具有再生潜力，但其天然成分缺乏适应这种恶劣微环境的能力，从而限制了治疗效果。在本研究中，我们提出了一种协同策略，通过反向适应和工程改造MSC外泌体来对抗骨关节炎中的铁死亡。首先，我们利用类似OA的氧化应激对MSCs进行预处理，从而确定miR-142a-3p是T-EXO（经叔丁基过氧化氢（TBHP）修饰的外泌体）中的关键治疗介质。随后，我们通过miR-142a-3p电穿孔技术（EXO^miR-142a-3p）改造MSC衍生的外泌体，使其具有独特的抗铁死亡和抗氧化特性。EXO^miR-142a-3p富含miR-142a-3p，该分子直接作用于GSK3β/Nrf2/SLC7A11轴，抑制铁死亡和活性氧（ROS）的积累。与未经改造的EXO相比，EXO^miR-142a-3p在保护软骨基质方面表现出更强的效果，并显著减缓了小鼠模型中的OA进展。通过将这些工程化的外泌体整合到可生物降解、靶向软骨且具有润滑性的微球平台上，我们实现了持续、定位的递送，增强了治疗效果的持久性和有效性。该平台在体外显著减轻了细胞外基质（ECM）的降解、铁死亡和氧化应激，并通过高效的关节内释放，在内侧半月板（DMM）诱导的OA模型中提供了显著的软骨保护作用。总体而言，这种创新方法不仅在临床前模型中提供了有效的软骨保护，还为OA和其他退行性疾病建立了精准的、适应微环境的再生疗法范例。

引言

骨关节炎（OA）是一种常见的退行性关节疾病，其特征是软骨退化、关节功能下降和疼痛。随着全球人口老龄化，OA现已影响近6亿人，严重影响了生活质量并带来了巨大的社会经济负担[1]、[2]。传统的OA治疗方法，包括物理治疗和药物治疗，只能暂时缓解症状，无法阻止疾病进展[3]。这凸显了迫切需要能够直接针对OA病理驱动因素的疾病修饰策略。

尽管多种机制参与了OA的发病机制，但氧化应激和铁死亡已被认为是关节退化的核心驱动因素[4]、[5]。ROS的过度积累会超出软骨细胞的抗氧化防御系统，导致细胞功能障碍和死亡[6]、[7]。重要的是，氧化应激还会促进铁死亡，这是一种依赖脂质过氧化的调控性细胞死亡形式，会加剧ECM的破坏和软骨退化。因此，能够减轻氧化应激和抑制铁死亡的疗法在改变OA进展方面具有巨大潜力。

微小RNA（miRNAs）是一类内源性非编码RNA，通常由19到22个核苷酸组成，是调控基因表达的关键因素，参与炎症、细胞存活和应激反应的调节[8]、[9]。其中，miR-142-3p被证实是炎症的关键调节因子，可影响促炎信号通路[10]。在OA背景下，miR-142-3p通过直接作用于HMGB1来抑制软骨细胞凋亡和炎症[11]。此外，miR-142a-3p还参与细胞生长、抗炎反应和凋亡的调节[12]、[13]、[14]。值得注意的是，miR-142a-3p可以抑制p38 MAPK和NF-κB通路，减轻炎症损伤，并在不同情况下增强干细胞的活力和分化[12]、[15]、[16]、[17]、[18]。尽管miR-142a-3p在调节凋亡、炎症和干细胞功能方面发挥了作用，但其在OA过程中对铁死亡调控的具体作用仍不明确。尽管miRNAs具有治疗潜力，但由于其在体内的快速降解和低生物利用度，需要强大的、靶向的递送系统来保持其稳定性和功能。

间充质干细胞（MSCs）通过免疫调节和组织修复显示出治疗OA的潜力[19]、[20]、[21]、[22]。重要的是，MSCs具有一定的微环境适应性，能够根据病理应激调整其分泌物质[23]。然而，直接移植MSCs面临诸多挑战，包括植入不良、分化不可预测以及潜在的致癌性，这些因素限制了其在临床应用中的效果[24]。因此，人们开始关注MSC衍生的旁分泌因子（MSC-EXO）——这些纳米级囊泡富含蛋白质、脂质和RNA，作为更安全、更可控的旁分泌信号介质[25]、[26]、[27]、[28]。作为miRNAs的天然载体，MSC-EXO可以调节氧化应激、炎症和细胞存活，使其成为OA治疗的理想候选物[29]。

尽管有这些优势，未经改造的MSC-EXO仍无法适应OA高度氧化和炎症的环境。它们的载物在生理条件下容易降解，且外泌体会被单核吞噬细胞系统迅速清除，导致在病变部位的滞留效果较差[30]。此外，外泌体内的miRNAs和其他小分子在生理条件下也容易降解[31]。这些限制影响了治疗效果的持久性，表明需要开发适应微环境的工程化外泌体。与其试图保护外泌体免受恶劣环境的影响，不如利用病理应激本身来重新编程MSC-EXO。在氧化应激下分泌的外泌体可能获得增强保护作用的载物（如特定的miRNAs），从而抑制铁死亡和ROS的积累，提供更好的软骨保护。这引发了一些关键问题：哪些外泌体miRNAs具有这种适应性，它们能否被用作OA的治疗剂？

在本研究中，我们采用了一种协同策略，通过反向适应和工程改造MSC外泌体来对抗骨关节炎中的铁死亡。首先，我们利用类似OA的氧化应激对MSCs进行预处理，确定miR-142a-3p是T-EXO中的关键治疗介质。然后，我们通过miR-142a-3p电穿孔技术（EXO^miR-142a-3p）改造MSC衍生的外泌体，使其具有独特的抗铁死亡和抗氧化特性。为了进一步提高治疗效果的持久性，我们将EXO^miR-142a-3p整合到可生物降解、靶向软骨的微球平台上，实现持续的关节内递送和润滑（图1）。这种综合方法在体外和DMM诱导的OA模型中有效减轻了氧化应激、铁死亡和ECM的降解，为适应微环境的再生疗法建立了范例。

细胞提取与培养

骨髓间充质干细胞（BMSCs）按照标准协议进行提取和培养[32]、[33]。具体来说，从成年雄性C57BL/6小鼠的股骨中分离出的细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素（Gibco）的α-MEM培养基中，在37°C和5% CO₂湿润环境中培养。选择传代3～4代的MSCs用于后续实验。提取外泌体之前，将MSCs用TBHP（Aladdin，上海，中国）预处理48小时。

软骨细胞的分离方法

ECM降解和ROS水平的升高是导致OA进展的关键因素

为了探讨骨关节炎的发病机制，我们分析了从GEO数据库获得的GSE207881数据集。差异分析显示，在OA中有409个基因上调和3,395个基因下调（图1A）。热图显示了正常样本和OA样本之间与氧化应激相关的差异基因分布（图1B）。GO富集分析显示，在细胞对氧化应激的反应方面存在显著差异。

讨论

OA是一种慢性炎症性疾病，其特征是关节软骨逐渐退化，导致关节功能障碍和疼痛。年龄、性别、肥胖、既往关节损伤、生活方式和遗传易感性等因素增加了OA的复杂性和高发病率[1]、[42]。目前的治疗策略主要集中在症状管理上，主要使用非甾体抗炎药和止痛药。虽然这些药物可以缓解疼痛，但无法阻止疾病进展

结论

在本研究中，我们设计了一种光交联润滑水凝胶微球封装的软骨靶向肽修饰工程外泌体系统，有效解决了外泌体快速清除和滞留效果差的问题。SA-GM@CAP-EXO^miR-142a-3p系统能够有效润滑生物界面，靶向GSK3β/Nrf2/SLC7A11轴，促进软骨再生，抑制铁死亡，防止ECM降解，表现出显著的保护效果

作者贡献声明

王金武：撰写初稿、可视化处理、软件应用、方法设计、数据分析、数据整理。蔡蕾怡：撰写、审稿与编辑、项目管理。张增杰：撰写、审稿与编辑、项目管理、概念构思。沈志豪：撰写初稿、验证、软件应用、方法设计、数据分析、数据整理。楼超：撰写、审稿与编辑、可视化处理、软件应用、方法设计、数据分析。郑文豪：

数据可用性

数据可应要求提供。

伦理声明

本研究已获得温州医科大学动物伦理委员会的批准（WIUCAS25040201）。

资助

本研究得到了浙江省基本公共福利研究项目（LQ24H060008）、温州市科技计划项目（GY20250280、Y2023043）以及浙江省医学健康科技计划（2025HY0585, 2022RC209）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢温州医科大学科学研究中心的优秀咨询和实质性支持。