来自西藏红景天（Rhodiola tibetica）内生真菌代谢产物的神经保护化合物，通过多靶点调控神经炎症来减轻中风后的功能障碍

《Bioorganic Chemistry》：Neuroprotective compounds from endophytic fungi metabolites of Rhodiola tibetica attenuate post-stroke deficits via multi-targeted modulation of neuroinflammation

缺血性中风迟效给药的化合物JK-1、TXY-1和R11-6通过抑制NF-κB/NLRP3炎症通路和增强IL-10、HO-1表达改善小鼠神经功能。

　　

陶荣荣|张子彦|李欣|张瑞|欧阳飞|林云诗|韩峰|齐俊凯|高瑞|唐晓媛|冯宝敏|郭娟|王欢|卢轩

中国大连大学生命与健康学院，大连116622

摘要

缺血性中风是导致残疾的主要原因之一，目前尚缺乏针对延迟干预的有效治疗方法。本研究从药用植物Rhodiola tibetica的内生真菌代谢物中分离出三种化合物（JK-1、TXY-1和R11-6），并评估了它们在中风后恢复中的疗效。在中风后3天开始每日口服给予JK-1、TXY-1和R11-6，在光血栓形成性中风小鼠中进行两周治疗后，显著改善了神经行为表现，表现为足部错误率显著降低以及粘附物清除潜伏期缩短。值得注意的是，即使仅治疗一周也观察到了显著的疗效。这些化合物减轻了中风小鼠梗死周围皮层的神经元损伤，表现为神经元密度增加以及突触蛋白PSD-95和p-CaMKII的保留。机制上，这三种化合物抑制了促炎NF-κB/NLRP3轴的激活，从而减弱了小胶质细胞的M1极化和星形胶质细胞的反应性。此外，它们通过诱导IL-10和HO-1增强了内源性防御机制，共同调节了中风小鼠的神经炎症级联反应。TXY-1和R11-6诱导的HO-1表达比JK-1组更强，这与它们对NF-κB活性的更强抑制作用一致。综上所述，这些发现表明，延迟给予这些化合物可以通过多靶点调节神经炎症来促进中风后的神经恢复，突显了Rhodiola-真菌共生体作为神经保护剂的可持续来源。

引言

缺血性中风是最常见的中风类型，是全球长期运动障碍的主要原因，给社会带来了巨大负担[1]、[2]。尽管再灌注疗法（如tenecteplase或alteplase溶栓术和机械取栓术）是急性治疗的基石，但其应用受到狭窄的治疗窗口和有限的可及性的显著限制，导致大多数患者无法得到明确的急性干预[3]、[4]。因此，超过一半的幸存者会出现持续的感官运动缺陷，这凸显了迫切需要针对中风急性期后复杂病理生理过程的有效延迟治疗策略。

失调的神经炎症是中风后进行性神经损伤的核心机制[5]、[6]、[7]、[8]。在初始缺血损伤后，小胶质细胞迅速被激活，从分支监视状态转变为变形虫样反应性表型[9]。虽然这种早期激活对于清除碎片和支持神经元生长因子至关重要，但持续的小胶质细胞激活和促炎M1样极化会通过过量产生细胞毒性介质（如肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β和活性氧（ROS）而造成进一步的神经元损伤[10]。这一级联反应主要由炎症转录因子核因子κB轻链增强子（NF-κB）和NOD样受体吡啶结构域包含3（NLRP3）炎性小体复合物的激活介导，它们通过caspase-1将pro-IL-1β和TNF-α转化为成熟形式，从而形成自我持续的炎症循环[11]。同时，星形胶质细胞发生反应性星形胶质增生，最初通过增强血脑屏障（BBB）和隔离病变部位起到保护作用。然而，持续的反应性星形胶质细胞会促进不适应性的胶质瘢痕形成，并释放血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶（MMP）-9等因子，最终破坏BBB的完整性，阻碍神经修复和功能恢复[12]、[13]、[14]、[15]。研究表明，特定的小分子化合物可以有效抑制VEGF受体[16]、[17]。因此，监测缺血性中风后VEGF表达动态是评估这些药物潜在疗效的有效方法。

内源性抗炎防御机制可以对抗这种有害的神经炎症反应，尽管在病理条件下它们常常被压倒。关键的保护途径包括IL-10，它通过STAT3信号通路抑制小胶质细胞的促炎极化和NLRP3激活[18]、[19]，以及血红素加氧酶-1（HO-1），它将促炎性血红素降解为抗氧化产物（如胆绿素和CO）以减轻氧化应激[20]、[21]。策略性地增强这些保护系统与抑制有害炎症相结合，是一种有前景的治疗方法。

天然化合物，特别是那些来自具有已知神经保护作用的传统药用植物的化合物，是多靶点治疗的丰富来源[22]。因此，探索和开发具有神经保护作用的药物产品对于治疗缺血性中风等神经系统疾病具有巨大潜力。Rhodiola tibetica是一种用于藏医的高海拔适应原，具有已证实的抗炎和抗氧化特性，与脑血管健康相关[23]。有趣的是，寄生于这些植物内的内生真菌产生了结构新颖的生物活性代谢物，通常具有更高的生物利用度[24]、[25]、[26]。目前正在进行一项系统研究，探讨生长在独特环境中的Rhodiola tibetica内生真菌的次级代谢物及其相关的生物活性。先前的一项研究从Rhodiola tibetica的内生真菌中分离出3,5-二甲基-8-甲氧基-3,4-二氢-1H-异色酮-6-醇（DMD/JK-1），这是一种强效的NLRP3抑制剂，在结肠炎模型中显示出疗效[25]。然而，这些内生真菌衍生物在神经系统疾病（特别是缺血性中风）中的治疗潜力仍大多未被探索。

基于先前的发现，从Rhodiola tibetica内生真菌的代谢物中分离出三种化合物，并通过核磁共振（NMR）光谱对其结构进行了表征（图S1–S9）。这些化合物分别为3,5-二甲基-8-甲氧基-3,4-二氢-1H-异色酮-6-醇（表S1）[27]、Alternaria E（表S2）[24]和3-脱氧异色酸（表S3）[28]，分别命名为JK-1、TXY-1和R11-6。使用小鼠缺血性中风模型评估了它们在中风治疗中的疗效，重点关注在中风后3天开始临床相关延迟时间窗内给予时对神经炎症和潜在防御机制的调节作用。本研究开创了将Rhodiola tibetica-真菌共生体作为新型多靶点治疗剂的可持续来源的探索，旨在减轻缺血性中风后的神经炎症损伤并促进恢复。

章节片段

化合物的分离

简而言之，化合物JK-1、TXY-1和R11-6分别从内生真菌Penicillium sp.（HJT-A-10）和Alternaria sp.（HJT-Y7）中提取，这两种真菌分别来自中国西藏山南市朗卡齐县的Rhodiola tibetica的根部和叶片。化合物制备和分离的详细程序在补充信息中有描述。JK-1、TXY-1和R11-6的化学结构和NMR数据也在补充信息中提供。

试剂

三种化合物改善了缺血小鼠的中风后运动功能

为了评估JK-1、TXY-1和R11-6在缺血性中风中的治疗效果，从中风后3天开始对PT诱导的缺血小鼠每日口服给予这三种化合物，并持续两周（图1A）。治疗期间所有组的体重保持稳定（图1B和C），表明没有全身毒性。然后使用网格行走和粘附物清除测试评估中风后的运动缺陷，这些测试与

讨论

缺血性中风仍然是全球长期残疾的主要原因，这凸显了在急性溶栓治疗狭窄时间窗口之外寻找有效干预措施的迫切临床需求。本研究证明，延迟口服给予来自Rhodiola tibetica内生真菌的新代谢物JK-1、TXY-1和R11-6，可以显著改善小鼠缺血性中风模型的神经功能恢复并减轻神经元损伤。

CRediT作者贡献声明

陶荣荣：撰写——原始草稿、可视化、验证、研究、数据管理、概念化。张子彦：撰写——原始草稿、可视化、验证、资源获取、研究、数据管理、概念化。李欣：可视化、验证、研究、概念化。张瑞：可视化、验证、研究、数据管理。欧阳飞：可视化、验证、研究、数据管理。林云诗：验证、正式分析、数据

财务支持

本研究部分得到了国家自然科学基金（82274628）、广东省自然科学基金（2023A1515030167）、广州市基础与应用基础研究计划（2024A04J4901）、广州中医药大学校医院联合基金项目（GZYZS2024U10）以及广州双一流大学和学科高质量发展项目、中央政府层面的中医药大学重点项目的支持

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。