《Bioorganic Chemistry》：Multimerization approach to improve a cell surface plectin binding cancer stem cell targeted peptoid drug?lead
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癌症干细胞表面转位plectin（STP）靶向三聚体peptoid PCS2T3.9抑制非小细胞肺癌（NSCLC）细胞迁移与增殖，选择性高且无正常细胞毒性。
查尔斯·奥武苏·安萨（Charles Owusu Ansah）| D. 戈米卡·乌杜加马苏里亚（D. Gomika Udugamasooriya）
休斯顿大学药理学与药学科学系，美国德克萨斯州休斯顿市马丁·路德·金大道4349号，健康大楼2层7033室，邮编77204-5037。
摘要
癌症干细胞（CSCs）或肿瘤起始细胞是一类具有自我更新和转移能力的耐药亚群。迄今为止，尚未开发出针对CSCs的特异性药物。Plectin是一种细胞骨架蛋白，在CSCs中会特异性地转移到细胞外膜（表面转位的plectin - STP），并促进其增殖、迁移、侵袭和转移。我们之前发现了一种针对STP的肽类化合物PCS2及其二聚体形式PCS2D1.2，它们能够选择性地结合非小细胞肺癌（NSCLC）来源的CSCs，并在体外和体内实验中显示出抗癌活性。本研究报道了PCS2D1.2的最小药效团结构，并对其进行了优化，以获得改进的三聚体肽类化合物PCS2T3.9。通过多种多聚化策略以及非关键残基的截短和连接子优化，最终得到了PCS2T3.9。实验结果显示，该化合物对高STP表达的H358非小细胞肺癌细胞的细胞毒性提高了21倍，而对低STP表达的H460细胞的影响最小。PCS2T3.9对正常支气管上皮细胞HBEC-3KT没有细胞毒性。此外，PCS2T3.9能有效抑制H358细胞（但不是H460细胞）的克隆形成和细胞迁移——这些都是CSC特征的体现。这些发现强烈表明高STP表达与癌症干细胞的特性相关，并证实了PCS2T3.9对CSCs的选择性靶向作用及其抗癌活性。PCS2T3.9对STP富集的CSCs的高度特异性和选择性细胞毒性作用，有望将副作用降至最低，使其成为开发针对CSCs的NSCLC治疗药物的有希望的候选分子。
引言
癌症转移导致了大约90%的癌症相关死亡病例。这种高死亡率主要归因于一类被称为肿瘤起始细胞或癌症干细胞（CSCs）的罕见亚群[1]、[2]、[3]、[4]。CSCs具有自我更新、分化和转移的能力，是肿瘤进展和治疗抵抗的主要驱动因素[5]、[6]、[7]。
肺癌是美国癌症相关死亡的主要原因。肺癌CSCs与非小细胞肺癌（NSCLC）的侵袭性和治疗难治性密切相关[8]、[9]。消除这些CSCs有望通过降低复发和转移的风险来改善患者预后。然而，由于肿瘤异质性、复杂的信号通路相互作用以及缺乏可靠的CSC特异性生物标志物，针对CSCs的治疗开发面临重大挑战[10]、[11]。尽管已经有多种与CSC相关的标志物（如ALDH1、CD133和CD44）和信号通路被研究作为治疗靶点，但这些因素的固有异质性和相互作用限制了CSC导向干预的临床效果[12]、[13]、[14]。此外，关键的CSC信号通路（如Hedgehog、Wnt、Notch）在正常组织稳态中的广泛参与引发了关于可能干扰重要生理过程的担忧[13]、[15]、[16]、[17]。鉴于CSCs在驱动转移和治疗抵抗中的关键作用，迫切需要寻找新的、普遍存在的、针对CSCs的特异性药物靶点，以改善NSCLC及其他侵袭性癌症患者的预后。
我们之前采用了基于微珠的双色（OBTC）组合细胞筛选方法[18]、[19]、[20]，“无偏倚”地鉴定出一种肽类配体PCS2，并确定其靶点为H358 NSCLC细胞表面的表面转位plectin（STP）[23]。Plectin是一种高分子量（约500 kDa）的细胞骨架蛋白，在哺乳动物组织和细胞类型中普遍表达。这种多功能蛋白作为关键的细胞连接器和分子支架，介导中间丝、细胞器和微管之间的相互作用，从而实现多种细胞功能，包括细胞间黏附、运动和信号转导[24]、[25]、[26]、[27]、[28]。最新研究表明，plectin会转移到细胞膜外表面，促进侵袭足的形成——这是癌细胞转移的关键步骤[29]、[30]、[31]、[32]、[33]。这种STP在卵巢癌、结直肠癌、前列腺癌和胰腺癌等多种恶性肿瘤中均有发现[31]、[32]、[34]。一些研究还证实STP的C端结构域暴露于细胞膜外表面[29]、[34]。已有研究使用脂质体[29]、肽[30]、抗体[35]和小分子[36]靶向STP，均在结肠癌、胰腺癌和卵巢癌中表现出细胞毒性效应。虽然癌症干细胞（CSCs）是已知的转移驱动因素，但STP在CSC生物学中的作用直到我们团队最近在NSCLC CSCs中鉴定出其表达之前尚未被探索[23]。
细胞间的通信是通过细胞表面的受体接收来自细胞外的信号并通过信号转导传递到细胞内的过程[37]。然而，多价相互作用（即多个配体同时结合多个受体位点）在自然界中非常普遍。例如，二聚体与二聚体或三聚体与三聚体之间的结合，比单价配体具有更高的结合亲和力和分子选择性[38]、[39]。多价结合提供了热力学和动力学优势，如通过多个结合位点的占据减少熵损失、受体聚集、提高局部结合表位的浓度以及空间稳定性[40]、[41]。二聚体配体是最简单的多聚体形式，由两个单体通过连接子连接而成。多项研究表明，优化连接子对于提高结合亲和力至关重要[42]、[43]、[44]、[45]、[46]。适当的配体空间排列可以增强结合亲和力，减少与受体结合时的应变[42]、[43]、[44]、[45]、[46]。例如，通过赖氨酸单元连接的两个PCS2单体组成的二聚体类似物表现出比单体形式更强的细胞毒性[47]。鉴于STP的C端结构域暴露于细胞表面，并且该结构域具有高度同源性[31]、[48]，我们推测进一步的多聚化可以使每个PCS2部分识别另一个结构域，从而进一步增强结合亲和力。根据距离的不同，每个PCS2可能识别多个STP拷贝中的一个结构域或同一蛋白质中的另一个结构域。为此，我们设计了不同连接子长度的PCS2多聚体（三聚体和四聚体），使用了赖氨酸、二氨基丙酸（DAP）、甘氨酸和聚乙二醇（PEG）等连接子。这些衍生物的生物活性通过标准的MTS细胞毒性测定进行了评估，并选择了一个最佳候选物进行进一步优化。我们还评估了该优化多聚体在克隆形成和细胞迁移方面的功能活性，这两者是转移过程的早期步骤。
部分摘要
一般信息
所有化合物均使用从Millipore Sigma（美国马萨诸塞州）购买的NovaSyn TGR树脂（0.15–0.23 mmol/g）合成。2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐（HBTU）和1-羟基苯并三唑（HOBt）从ChemPep Inc.（美国佛罗里达州）购买。所有一级胺、Fmoc保护的氨基酸和ivDde保护的氨基酸、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）、溴乙酸、二异丙基碳二亚胺（DIC）、哌啶、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）等试剂也均来自相同供应商。
PCS2D1.2的最小药效团结构鉴定
采用丙氨酸/肌氨酸扫描方法确定了PCS2D1.2的最小药效团结构。选择这种方法是因为它对母体化合物的构象影响较小，并且便于识别对生物活性至关重要的侧链[49]。PCS2单体由八个残基组成，包括三个氨基酸和五个肽类残基（图1A）。正如我们之前报道的，PCS2单体没有细胞毒性，而PCS2D1.2二聚体则表现出...
结论
本研究描述了PCS2T3.9的设计、合成和功能评估。PCS2T3.9是一种经过连接子和序列优化的三聚体肽类化合物，能够选择性地靶向NSCLC细胞中的表面转位plectin（STP）。最小药效团结构分析表明，虽然第1位的甲硫氨酸对于活性不是必需的，但第2、3、4和7位的带正电荷残基以及第5和6位的疏水残基对于细胞毒性效应至关重要。
研究局限性和未来方向
本研究的重点是通过多聚化设计并合成改进的PCS2化合物，然后进行初步的生物学实验以验证其活性。尽管本研究为三聚体肽类PCS2T3.9的细胞活性和选择性提供了重要见解，但仍需承认一些局限性。肿瘤球形成实验和CSC特异性标志物（如CD133、ALDH1）的评估将有助于进一步了解CSC的相关效应。
作者贡献声明
查尔斯·奥武苏·安萨（Charles Owusu Ansah）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学设计、实验设计、数据分析、数据管理。D. 戈米卡·乌杜加马苏里亚（D. Gomika Udugamasooriya）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化结果制作、验证、实验监督、资源协调、项目管理、方法学设计、实验设计、资金申请、数据分析、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）的SPORE项目（编号5P50CA70907和P20CA221731）以及休斯顿大学GEAR项目的资助（Udugamasooriya）。我们感谢UT-Southwestern医学中心的John Minna博士提供的肺癌细胞系。
