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《Biosensors and Bioelectronics》：A Wearable System Enabling Acute Stress Monitoring and Closed-Loop Mitigation through Transcutaneous Median Nerve Stimulation

miRNA多组学定量新方法基于发夹探针诱导的等温扩增与双功能分子信标的荧光响应，通过设计带3’-悬臂的分子信标作为引物激活LAMP扩增，利用链置换分离淬灭荧光实现多重检测。发夹探针融合单核苷酸区分技术解决同源miRNA特异性问题，显著提升灵敏度至10 zmol水平，适用于痕量生物样本分析。

胡文静|周慧云|刘晓楠|严江伟

山西医科大学法医学学院，太原，030001，中国

摘要

miRNA是一种由约22个核苷酸组成的非编码RNA，在不同的生物医学场景中作为生物标志物，其准确性取决于其表达水平。miRNA的特征化程度越高，所得结果越精确，这凸显了多重miRNA定量分析的必要性。尽管基于PCR的方法已被广泛应用，但由于目标分子的微量存在以及样本的降解，这些方法在液体活检、产前诊断和法医鉴定中的应用受到限制。尽管环介导等温扩增（LAMP）具有更高的灵敏度和特异性，但由于miRNA片段较短，仍无法实现其检测，更不用说多重定量了。本研究开发了一种基于双功能分子信标对发夹探针触发等温扩增反应的多重miRNA定量新策略。设计了两种发夹探针与目标miRNA杂交，并通过连接酶融合形成哑铃结构作为LAMP的触发剂。这种双功能分子信标具有3’突出端，能够通过退火与哑铃结构结合并参与扩增过程。位于信标上的淬灭剂-荧光团对通过链置换分离，产生荧光以监测每个目标miRNA的扩增情况，从而实现多重定量。该策略解决了LAMP对模板长度的要求与miRNA短片段之间的矛盾，即使是在逆转录后生成的cDNA延长片段的情况下也是如此。此外，通过发夹探针与单核苷酸的特异性结合，进一步提高了检测的准确性，而这在逆转录过程中是无法实现的。这一方法使用了通用的发夹探针和分子信标，为多重miRNA分析提供了通用平台。

引言

miRNA是一种小型非编码RNA，仅包含18-24个核苷酸，在生物体内起着重要的调控作用。自1993年从秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中首次发现miRNA以来，至今已发现并研究了大约1000种miRNA。在生物体内，基因表达受到严格调控，而miRNA是转录后调控的关键调节因子。miRNA通过靶向mRNA来控制蛋白质的翻译（Bartel, 2004）。由于miRNA在细胞增殖、分化和凋亡等过程中的调控作用，它被广泛应用于疾病诊断和法医鉴定等生物医学领域（Gu等人，2019；Lee等人，2025；Li等人，2022；Silva等人，2015）。由于miRNA的生物学效应依赖于其表达水平的分析，因此对其定量至关重要。此外，细胞过程中的表型变化通常与多种miRNA相关。miRNA的特征化程度越高，可获得的参数就越多（Wang等人，2022；Yanaihara等人，2006）。虽然并行单一样本反应也可以同时分析多种miRNA，但这会消耗较多的样本和时间，尤其是对于样本量有限的样本。例如，循环miRNA作为体液中的微量生物分子，已被用于癌症液体活检和非侵入性产前诊断（Gu等人，2019；Li等人，2022）。然而，在法医实践中，样本往往因犯罪破坏或恶劣环境因素而受到限制和降解，导致miRNA含量极少（Glynn, 2020；Wang等人，2022）。因此，多重miRNA的协同定量可以显著提高生物医学分析的准确性。

目前，已经开发了多种基于PCR的多重miRNA定量方法（Barberán-Soler等人，2018；Hawkins和Guest，2017；Moltzahn等人，2011）。然而，由于miRNA在降解样本和体液中的微量存在以及同源RNA的背景干扰，需要更高的灵敏度和特异性才能获得可靠的定量结果。尽管环介导等温扩增（LAMP）具有较高的灵敏度和特异性，并可作为PCR的替代方法，但其较长的模板需要被切割成八个区域以便引物识别（Nagamine等人，2002）。而从茎环结构或poly(A)尾逆转录生成的cDNA仍然较短，无法作为LAMP的模板，即使经过延长也是如此。此外，短长度限制了引物识别区域，使得难以区分同源miRNA之间的高度相似序列。因此，LAMP难以检测miRNA，更无法实现多重定量。此外，miRNA的逆转录不仅缺乏特异性（因为仅使用少量碱基进行目标识别），而且不同miRNA之间的扩增效率也不同，导致定量结果不准确（Munafó和Robb，2010）。

本研究基于双功能分子信标对发夹探针触发等温扩增反应（mHPIA）建立了多重miRNA定量新方法。两种定制的发夹探针通过互补碱基对识别并结合目标miRNA，随后通过磷酸二酯键的连接形成哑铃结构，作为LAMP的触发剂。更重要的是，设计了一种具有3’突出端的单臂分子信标，作为环引物参与扩增过程。位于信标上的淬灭剂-荧光团对通过链置换分离，产生荧光信号以监测多重miRNA的扩增情况。该设计不仅克服了miRNA片段过短无法触发LAMP的问题，还能在存在单碱基差异的情况下区分同源miRNA。此外，还采用了基于尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）的抗气溶胶策略来消除交叉污染，解决了LAMP高灵敏度和大量扩增产物带来的问题。以hsa-miR-144-3p、hsa-miR-658和U6为例，即使每个目标分子的浓度低至10 zmol，也能实现同时定量。该方法使用通用的发夹探针和分子信标，实现了多重miRNA的定量。

寡核苷酸

作为三重定量模型，选择hsa-miR-144-3p作为血迹的生物标志物，hsa-miR-658作为唾液的生物标志物。同时选择U6作为内源性对照。使用Primer Premier 5.00软件（Premier Biosoft，美国旧金山）为每个目标定制了一套包括上游探针（UP）和下游探针（DP）以及名为loop reporter（LR）的分子信标。

mHPIA设计

本研究建立了一种基于双功能分子信标对发夹探针触发等温扩增反应的多重miRNA定量方法，该方法包括发夹探针与目标miRNA之间的退火以及单臂分子信标的链置换引发的荧光激发。两种定制的发夹探针（UP和DP）具有通用的茎环结构。

讨论

miRNA是一种小型非编码RNA，在基因调控中起关键作用。由于其在不同细胞过程中的表达水平不同，miRNA被广泛用作多种生物医学应用中的生物标志物。通过定量更多的miRNA，可以获得更多维度的数据，从而提高结果的准确性。因此，多重miRNA定量在生物医学分析中起着重要作用。尽管已经有多种基于PCR的技术可用，

结论

我们开发了一种基于双功能分子信标对发夹探针触发等温扩增反应的多重miRNA定量新方法。两种定制的发夹探针与目标miRNA互补结合，通过连接酶融合形成哑铃结构，作为LAMP的触发剂。此外，具有3’突出端的双功能分子信标不仅加速了扩增过程，还能区分不同的目标miRNA。

作者贡献声明

严江伟：监督、资源调配、方法设计、实验设计、资金获取、概念构思。刘晓楠：写作与审稿编辑、监督、资源调配、方法设计、实验设计、资金获取、概念构思。周慧云：方法设计、实验设计。胡文静：初稿撰写、方法设计、数据管理、概念构思

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：82030058）和山西省自然科学基金（项目编号：202203021212378）的支持。