通过磁捕获和深度学习实现的开放表面数字ELISA技术，能够快速且高灵敏度地检测非洲猪瘟病毒

《Biosensors and Bioelectronics》：Open-surface digital ELISA enabled by magnetic trapping and deep learning for rapid and highly sensitive detection of African swine fever

非洲猪瘟p30抗原的高灵敏快速检测方法研究。提出开放表面数字ELISA平台，通过磁珠阵列构建开放微腔替代传统封闭系统，结合循环流微流控增强抗原结合，利用TSA信号放大技术提升检测灵敏度，达21fg/mL。AI驱动的Mask R-CNN模型实现准确自动化分析，血清验证灵敏度100%，特异性95%。

作者：赵永红、廖淑飞、李亚志、王一博、李浩楠、王家琦、刘一仁、董建培、孙明霞、周建华

深圳中山大学医学院，中国深圳518107

摘要

非洲猪瘟（ASF）是一种由ASF病毒引起的高致命性和传染性的动物疾病，会导致巨大的经济损失。早期检测至关重要，因为病毒载量最初较低，需要高度敏感地检测p30抗原。尽管现有的数字ELISA能够灵敏地检测p30，但其性能受到微腔利用效率低（导致泊松噪声限制的灵敏度）和图像识别精度低的限制。本研究提出了一种开放表面数字ELISA（OS-dELISA）平台，该平台将开放空间磁珠（MB）阵列与人工智能相结合。该平台利用磁捕获形成MB阵列，作为开放空间微腔。结合往复流式微流控技术和原位酪胺信号放大技术，这种设计消除了将免疫复合物封装到封闭微腔中的额外步骤，提高了微腔利用效率和抗原捕获效率，并增强了灵敏度。改进的基于掩模区域的卷积神经网络能够实现大规模数据集的智能和准确图像识别。OS-dELISA在17分钟内实现了高灵敏度的p30检测，检测限为21 fg/mL。血清样本验证显示其灵敏度为100%，特异性为95%。通过结合微流控技术和人工智能，OS-dELISA为动物疾病的智能诊断提供了强大的工具。

引言

非洲猪瘟（ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的高致命性和传染性的动物疾病。ASFV攻击巨噬细胞，破坏宿主免疫力，并引发炎症风暴，最终导致广泛的血管损伤和多器官衰竭（Gaudreault等人，2020年）。由于ASFV在猪之间的接触传播、通过饲料传播和环境传播方面的高度适应性，以及其在血液、排泄物和屠宰场环境中的长期存活能力，ASFV具有极强的传染性。因此，控制疫情需要大规模扑杀操作，这不仅会导致猪肉产量的突然下降，还会严重扰乱猪肉供应链并造成巨大的经济损失（Coelho等人，2025年）。此外，ASFV多基因家族内的高度遗传多样性显著阻碍了预防性疫苗和治疗剂的发展（Li和Zheng，2025年）。迄今为止，尚无有效的控制措施。因此，在病毒载量极低的潜伏期及时捕获感染信号，实现超早期和准确的检测并迅速隔离以中断传播链，对于预防和控制这种疾病至关重要。

在ASF感染的早期阶段，宿主的病毒清除和特异性抗体反应尚未完全激活，导致病毒载量持续增加。在病毒复制开始但抗体尚未产生的最初0-8天内，通过检测低病毒载量的ASFV可以实现超早期和准确的检测（Tesfagaber等人，2024年）。传统的早期病毒检测通常通过核酸扩增或抗原检测进行。然而，现有的基于qPCR的核酸检测方法复杂、耗时，并需要专门的实验室条件（Yoo等人，2021年），使得抗原检测更适合大规模即时检测（POCT）。尽管如此，当前的ASFV抗原检测方法灵敏度不足，只能识别病毒载量≥10^5拷贝/mL的样本，难以检测低病毒载量。因此，提高抗原检测的灵敏度对于实现ASF的超早期检测至关重要。值得注意的是，ASF的p30抗原在感染后2小时就开始表达（Tian等人，2024年），并可能引发强烈的体液免疫反应（Alejo等人，2018年），使其成为超早期检测的理想生物标志物。

数字ELISA的进步使得超早期生物标志物的检测成为可能（Zhang等人，2024年）。数字ELISA的发展可以大致分为三种技术路线。第一类是Simoa（代表单分子阵列），这是一种基于微孔的数字ELISA，其中免疫复合物结合的磁珠（MBs）（Kang等人，2021年；Kim等人，2024a；Kim等人，2024b）被封装在半封闭的微孔中，并在这些微孔内检测单分子酶促反应的信号，实现了飞摩尔灵敏度（10^2拷贝/mL）（Rissin等人，2010年；Wilson等人，2016年）。第二类是基于微滴的数字ELISA，使用皮升级微滴封装免疫复合物结合的MBs，大大提高了免疫复合物（包含目标分子）进入完全封闭微滴的概率（Cohen等人，2020年）。然而，半封闭微孔和完全封闭微滴系统都面临一个共同的限制：目标分子进入微腔的过程遵循泊松分布。在目标分子数量极低的情况下（n），随机捕获过程会导致显著的统计波动（泊松噪声，1/√n），这阻碍了数字ELISA检测灵敏度的进一步提高（Chen等人，2022年）。理论研究表明，传统数字ELISA中的微腔利用率通常只有10-30%。将其提高到80%以上可以将捕获的目标分子数量提高2-3个数量级，从而大幅抑制泊松噪声（Zhang等人，2024年）。第三类涉及直接成像或基于流动的MB计数，其中荧光探针与免疫复合物结合的MBs结合，通过显微镜或流式细胞术计数单个MBs（Wang等人，2017年；Wu等人，2020年）。这种方法避免了封装过程，但新的挑战包括确保MBs的充分分散，以避免因粘附和聚集导致的计数偏差，以及克服单个MB的弱信号，这些因素使得可靠检测变得复杂。

为了解决上述挑战，本研究开发了一种基于平坦MB阵列、酪胺信号放大（TSA）和人工智能（AI）辅助的荧光MB识别的开放表面数字ELISA（OS-dELISA）平台，用于在ASF的超早期阶段高灵敏度检测p30抗原（图1）。OS-dELISA的工作流程包括四个主要步骤：（i）通过磁捕获和珠子压降在PDMS涂层的基底上构建高密度MB阵列，每个MB作为开放表面检测单元，从而取代传统的封闭微腔，实现成本效益高的制造。（ii）在MB阵列上进行夹心免疫测定以捕获p30抗原。在此步骤中使用往复流（RF）技术促进重复的抗原-抗体相互作用，显著加速检测过程（Liu等人，2021年）。随后通过TSA策略进行原位荧光信号放大。（iii）捕获MB阵列的明场和荧光图像以供后续分析。（iv）使用Mask R-CNN模型自动、高精度地识别、分割和计数阳性MBs，确保结果解释的可靠性和效率。实验结果表明，OS-dELISA在17分钟内完成了p30的检测，检测限低至21 fg/mL。在血清样本验证中，其灵敏度为100%，特异性为95%。

所提出的OS-dELISA平台包含两项重大创新。首先，构建了MB阵列以替代传统的半封闭微孔和完全封闭微滴微腔系统。在这种设计中，每个MB直接作为“开放空间（OS）信号单元”，消除了对物理微腔的需求。因此，所有MB都可以捕获目标分子，显著提高了微腔利用效率和检测效率。此外，为了解决单个MB信号弱的问题，在MB阵列表面引入了TSA策略。TSA策略是一种原位共价交联信号放大策略，其中酶促反应诱导酪胺衍生物在目标蛋白周围特异性沉积，导致信号分子（如荧光染料）的局部积累（Cao等人，2021年）。当应用于MB阵列时，放大的信号严格限制在单个MB上，实现了精确的信号获取并显著提高了检测精度。其次，整合了Mask R-CNN AI算法（Zhang等人，2025年），实现了MB图像的自动化和高精度识别和分割。MB阵列设计从根本上克服了与半封闭或完全封闭微腔相关的空间限制，大大提高了微腔利用率，从而突破了数字ELISA的灵敏度限制。结合AI算法，该平台通过应用深度学习自动和准确地分析检测图像，提供了客观可靠的动物疾病诊断结果。

材料与方法

“材料与方法”的详细信息在“支持信息（SI）”中描述。

MB阵列基微流控芯片的制备

按照上述策略，我们制备了抗体修饰的MBs和微流控芯片（SI，S1.2），将抗体修饰的MBs固定在微流控通道内，并阐明了在微流控通道基底上形成OS MB阵列的机制。用于构建MB阵列的抗体修饰MBs是通过EDC/NHS偶联（SI，S1.3）制备的，通过该过程将抗p30捕获抗体共价连接到羧基化的MBs上

结论

本研究开发了一种基于OS-dELISA平台的新型数字ELISA，用于高灵敏度检测ASF p30抗原。在该平台中，通过磁捕获在微流控通道内构建了高密度MB阵列。应用开放空间检测模式替代了传统的封闭微腔，并整合了TSA策略以实现原位信号放大，有效克服了微腔利用的限制。检测限（LOD）降低到了21

CRediT作者贡献声明

周建华：撰写 – 审稿与编辑、资金获取、概念化。孙明霞：方法学。赵永红：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、方法学、资金获取、数据管理。王家琦：数据管理。董建培：方法学。刘一仁：方法学。李亚志：方法学、数据管理。廖淑飞：撰写 – 审稿与编辑、方法学、数据管理、概念化。李浩楠：撰写 – 审稿与编辑。王一博：方法学

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢深圳科技计划（编号JCYJ20220818102014028、JCYJ20230807111120043）、中国博士后科学基金会（编号2024M763751）、CPSF博士后奖学金计划（编号GZC20233295）、国家自然科学基金（编号22574178、22174167、62205382、62201624、32171192、92269106）以及国家重点研发计划（编号2023YFF0714400、2021YFF0703300）的财政支持。