将高效信号放大技术与磁分离技术整合到均匀的电化学体系中：实现 aflatoxin B1 和 ochratoxin A 的超低背景水平的同时检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Integrating Efficient Signal Amplification and Magnetic Separation into a Homogeneous Electrochemical Strategy: Achieving Ultra-Low Background Simultaneous Detection of Aflatoxin B1 and Ochratoxin A

本研究开发了一种高效且灵敏的均相电化学传感器，结合金属有机框架（UiO-66）信号放大技术与磁分离技术，实现黄曲霉毒素B1（AFB1）和赭曲霉毒素A（OTA）的同时检测。检测限分别为0.51 pg/mL和0.42 pg/mL，范围覆盖1 pg/mL-100 ng/mL和500 fg/mL-100 ng/mL，有效降低背景干扰并提高检测准确性。

　　

汤春元|袁炳正|李立波|罗丽君|游天燕

农业工程学院，教育部现代农业装备与技术重点实验室，江苏大学，镇江，江苏212013，中国

摘要

共存的黄曲霉素B1（AFB1）和赭曲霉毒素A（OTA）会产生协同的毒性效应，尤其是致癌作用，这突显了同时检测它们的重要性。尽管均相策略可以避免多目标检测过程中电极表面的交叉干扰，但信号放大过程的复杂性和背景干扰仍然是一个挑战。本研究将一种高效的信号放大策略和磁分离技术整合到均相电化学策略中，用于同时检测AFB1和OTA。首先，利用基于锆的金属有机框架（UiO-66）对电活性染料的吸附能力，通过搅拌法将适配体与其结合，然后通过中性红（NR）/亚甲蓝（MB）进行富集，制备出信号放大探针。接着，利用互补DNA（cDNA）功能化的Fe₃O₄@PtNPs实现双链杂交来捕获目标分子。当目标存在时，适配体的高特异性会促使信号探针释放。同时，外部磁铁可以快速去除与目标无关的背景干扰物质。通过巧妙地结合低背景和高效信号放大策略的优势，该方法成功实现了对AFB1和OTA的高灵敏度同时检测。AFB1和OTA的检测范围分别为1 pg/mL至100 ng/mL和500 fg/mL至100 ng/mL，检测限分别低至0.51 pg/mL和0.42 pg/mL。总体而言，这一策略为实现多种霉菌毒素的高效灵敏检测提供了一种令人满意的探索方法。

引言

霉菌毒素污染在谷物和饲料的生产、收获和储存过程中尤为常见。因此，人类和动物经常暴露于多种霉菌毒素中（Wang等人，2025年；Zhou和Tang，2020年）。其中，黄曲霉素B1（AFB1）和赭曲霉毒素A（OTA）是最常同时出现的霉菌毒素，它们显著的协同毒性效应加剧了致癌风险（Alassane-Kpembi等人，2017年；Joubrane等人，2020年）。因此，开发一种能够同时检测AFB1和OTA的方法具有重要意义。值得注意的是，电化学方法因其快速响应和强便携性而被认为是非常有前景的检测手段（Liu等人，2020年；Wang等人，2024年；Wei等人，2020年）。然而，对于传统的双目标检测电化学生物传感器，需要在电极表面修改不同的信号探针和识别元件，这是一个劳动密集型过程。此外，非均相界面不可避免地会导致交叉干扰问题，从而降低检测的灵敏度和重复性，阻碍了电化学生物传感器的商业潜力（Li等人，2022年；Zhang等人，2023年）。相比之下，均相传感策略能够在溶液中高效识别目标，信号生成不受电极表面限制，有利于提高检测灵敏度。此外，这种方法避免了繁琐的电极修饰过程，有效缩短了检测时间，为高效灵敏地检测双重目标铺平了道路（Ma等人，2024年；Ni等人，2018年；Yao等人，2024年）。

尽管具有这些优势，但高效简单的信号放大策略仍然是均相电化学系统中的一个技术障碍。大多数先前报道的生物传感器依赖于复杂的信号分子标记，这增加了传感器开发的技术难度。此外，为了提高灵敏度，通常引入酶催化进行信号放大。然而，这种方法会增加成本，并抑制电化学响应的放大效果（Chang等人，2019年；Zhang等人，2024年）。因此，开发一种无酶无标记的电信号放大策略被认为是一个非常有前景的替代方案。近年来，金属有机框架（MOF）纳米材料显示出良好的前景，具有超高的比表面积和多孔结构，可以加速响应时间和信号放大（Bao等人，2020年；Liu等人，2021年；Wu等人，2024年）。特别是基于锆的MOF（UiO-66），由于其高孔隙率和高效的吸附能力，已被广泛用于染料吸附应用（Liu等人，2023年；Wang等人，2016年；Wei等人，2023年）。利用这一点，我们设想使用UiO-66作为载体来富集电活性染料，并通过简单搅拌制备信号探针。这种设计大大简化了材料制备过程，并进一步实现了信号放大。此外，作为一种特定的寡核苷酸，适配体在溶液中表现出高亲和力和优异的稳定性，使其作为目标识别工具具有明显优势（Yang等人，2023b）。令人惊讶的是，UiO-66对磷酸骨架具有高亲和力，且可以通过Zr?O?P键轻松实现适配体的功能化（Wu等人，2025年；Yu等人，2020年）。基于此，通过充分利用UiO-66作为载体的优势，可以构建一种无需酶或标记的信号放大策略。

此外，实际样品中的复杂基质带来了极高的检测精度要求。然而，在传统的均相系统中，电活性探针在整个检测过程中始终存在，这通常会导致高背景信号和低信噪比，从而限制了检测灵敏度并可能导致假阳性结果（Li等人，2022年；Yin等人，2019年；Yu等人，2022年）。因此，开发能够减少背景信号的新方法至关重要。同时，为了提高分离背景干扰的效率，磁分离技术近年来受到了广泛关注。这种方法基于磁性材料，具有操作简单和分离速度快的优点（Lin等人，2024年；Liu等人，2025b）。例如，Li的研究小组通过使用磁性三维DNA纳米机器构建了均相生物传感平台，实现了低背景和高灵敏度的生物标志物检测（Yang等人，2023a）。受此启发，可以使用互补DNA（cDNA）功能化的磁性材料作为捕获探针。通过与适配体形成双链连接，可以很容易地通过外部磁场去除干扰物质，从而实现超低背景下的精确检测。

在这项工作中，为了实现AFB1和OTA的超低背景和高灵敏度检测，将一种无酶无标记的信号放大策略与磁分离技术整合到了均相系统中。生物传感平台的制备过程如图1所示。首先，将AFB1（Apt1）和OTA（Apt2）的相应适配体固定在UiO-66上。然后，利用UiO-66的多孔性质，将中性红（NR）/亚甲蓝（MB）吸附在其上作为信号放大探针。此外，使用Fe₃O₄@Pt纳米颗粒（Fe₃O₄@PtNPs）作为磁性捕获探针，并通过稳定的Pt?S键固定巯基（?SH）功能化的互补DNA（cDNA1和cDNA2）。信号探针通过双链固定在Fe₃O₄@PtNPs的表面。在AFB1和OTA存在的情况下，目标与适配体之间的强特异性结合会导致信号探针的释放。通过外部磁场快速分离非目标干扰物后，上清液只包含与目标浓度成正比的信号输出。这种方法不仅显著缩短了检测时间，还通过磁分离辅助技术最小化了均相系统的背景信号，从而显著提高了灵敏度和准确性。实验结果证实，所开发的均相生物传感器性能令人满意。更重要的是，该检测平台可以轻松扩展到多种霉菌毒素的同时检测。

实验部分

材料、试剂、设备和实验程序详见补充材料。

Apt1-UiO-66@NR和Apt2-UiO-66@MB的特性

图1A显示了Apt1-UiO-66@NR和Apt2-UiO-66@MB的合成路线。利用UiO-66对DNA链的亲和力，大量适配体被固定在UiO-66的表面。随后，加入牛血清白蛋白（BSA）以确保Apt-UiO-66复合物在溶液中的稳定性。最后，通过简单搅拌NR/MB与Apt-UiO-66，使其吸附在Apt-UiO-66上。UiO-66的形态通过...

结论

总结来说，本研究将高效的信号放大策略和磁分离技术整合到均相电化学系统中，成功开发了一种高灵敏度的均相电化学生物传感器，用于同时检测AFB1和OTA。通过用UiO-66富集电活性染料，开发出了一种简单高效的信号放大探针。此外，使用磁性捕获探针来固定信号探针，当目标存在时...

CRediT作者贡献声明

袁炳正：软件、资源。李立波：验证、监督。汤春元：撰写——原始草稿、研究、数据管理。游天燕：撰写——审阅与编辑、监督、概念化。罗丽君：撰写——审阅与编辑、方法学、形式分析

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：22374061）、江苏省高等教育机构优先学术发展计划（编号：PAPD-2023-87）以及江苏省研究生研究与实践创新计划（KYCX25_4243）的支持。