《Biotechnology Advances》：Modulation of
Clostridioides difficile virulence by metabolites derived from probiotic consortia and genetically edited strains
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本综述系统阐释了从传统“杀菌”到“抑毒”的CDI治疗范式转变，聚焦于通过多组学指导的微生物代谢干预（如恢复次级胆汁酸代谢、增强SCFA生成、干扰QS系统）精准抑制C. difficile的毒素表达、生物膜形成及孢子萌发等关键毒力表型，并展望了合成生物学赋能下一代活体生物治疗制品（LBP）的临床转化前景。
1. 引言
艰难梭菌感染（CDI）因其高复发率和抗菌素耐药性成为严峻的临床及公共卫生挑战。传统广谱抗生素或非特异性益生菌补充策略常导致肠道生态系统的附带损害，反而加剧耐药菌株的出现。当前微生物生物技术领域正经历从病原体清除到精准抑制毒力的范式转变，其核心策略是靶向维持C. difficile在肠道环境中致病性的关键代谢与调控网络。
新兴的多组学方法揭示了C. difficile与肠道共生微生物间关键的分子互作。针对性微生物干预——特别是恢复次级胆汁酸代谢（由bai操纵子介导）、增强短链脂肪酸（SCFA）产量以及破坏群体感应（QS）系统（如luxS/AI-2和agr）——可显著抑制关键毒力特征，包括毒素表达、孢子形成和生物膜形成。基于这些机制见解，该领域正超越传统益生菌，迈向新一代设计型疗法，包括工程化益生菌、遗传定义的联合菌群以及活体生物治疗产品（LBP），所有这些均设计用于靶向的、基于机制的作用，而非经验性地调节肠道生态系统。
代谢工程与合成生物学的整合极大地拓展了这一治疗前景。这些学科使得能够设计执行靶向治疗功能的益生菌底盘菌株，包括分泌群体淬灭（QQ）酶、精确转化胆汁酸以及优化SCFAs的生物合成。此类工程化功能不仅增强了治疗的可预测性和有效性，也为稳健的工业化转化铺平了道路。最终，这些先进生物制剂的成功临床部署取决于克服关键的生产挑战，特别是在可扩展的厌氧发酵、确保制剂稳定性以及建立清晰的监管途径方面。
1.1. 肠道微生物群、生态失调与艰难梭菌的入侵之门
肠道微生物群作为一个动态生化网络运作，对维持宿主代谢、免疫耐受及抵御病原体的定植抗力至关重要。其功能性输出——超越单纯的分类学多样性——由短链脂肪酸（SCFAs）和胆汁酸衍生物等关键代谢物定义，这些对肠道稳态至关重要。这些分子作为关键的调控信号，塑造微生物群落相互作用并直接影响机会性定居者的毒力途径。
当这种稳态平衡被打破时，就会出现生态失调状态，其特征是关键共生菌（如Faecalibacterium prausnitzii）的丧失、SCFA产量减少以及胆汁酸代谢的改变。这种失调常由广谱抗生素暴露、饮食西化、慢性炎症状态或反复住院触发，所有这些都会选择性耗竭严格厌氧菌，同时有利于耐氧的机会性菌。由此产生的产丁酸 Firmicutes 和转化胆汁酸的 Clostridia 的崩溃，在代谢和免疫水平上破坏了定植抗力，为C. difficile孢子萌发和生态位优势创造了许可条件。
研究表明，携带负责初级胆汁酸7-α-脱羟基作用的bai操纵子的Firmicutes细菌的特异性耗竭，与次级胆汁酸库的耗竭以及随之更高的CDI复发风险密切相关。次级胆汁酸代谢的恢复代表了抑制C. difficile孢子萌发和营养体生长的重要机制。
1.1.2. 艰难梭菌：形态、毒力与耐药性
C. difficile的致病性由一个复杂的调控网络启动，该网络在易感的肠道环境中整合了孢子萌发、群体感应和毒素表达。虽然营养体形式可以无症状持续存在，但广谱抗生素诱导的生态失调为孢子萌发和随后肠道上皮的定植创造了许可生态位。
宿主来源和微生物群修饰的信号介导了针对化学刺激物萌发的决定。初级胆汁酸（如牛磺胆酸）作为有效的萌发促进剂，通过结合假蛋白酶受体CspC发挥作用。这种结合启动了涉及CspB和SleC的蛋白水解级联反应，最终导致皮层水解和孢子萌发。相反，由携带bai操纵子的共生菌产生的次级胆汁酸——特别是脱氧胆酸（DCA）和石胆酸（LCA）——作为同一萌发过程的有效抑制剂，从而维持了关键的定植屏障。
次级胆汁酸和SCFAs在C. difficile发病机制中的抑制作用已明确，但其生物学效应高度依赖于浓度。实验研究表明，次级胆汁酸在微摩尔至低毫摩尔浓度范围内抑制C. difficile孢子萌发和营养生长。最低抑制或抑制阈值通常在0.05至0.5 mM之间，根据菌株背景和实验条件而异。值得注意的是，超过这些生理范围浓度时，胆汁酸可能对细菌细胞和宿主上皮细胞产生有害效应，凸显了确定功能性而非最大抑制剂量的重要性。
SCFAs，包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐，对C. difficile的生理学产生剂量依赖性效应。体外和体内研究均表明，在健康结肠中观察到的浓度（通常为10-30 mM）下，丁酸盐和丙酸盐可抑制毒素基因表达、降低孢子形成效率并改变细胞能量代谢。低于此阈值则可能产生有限或不一致的效果。这些定量关系强调了恢复生理代谢物浓度而非超过它们，对于实现一致的毒力抑制的重要性。
毒力在转录水平上由致病性基因座（PaLoc）控制，该基因座编码主要毒素TcdA和TcdB及其调控伙伴TcdR（一种替代σ因子）、TcdC（一种推定的抗σ因子）和TcdE（一种holin样蛋白）。分泌后，这些毒素协同作用，使Rho GTPases糖基化、破坏宿主肌动蛋白细胞骨架并引发强烈的炎症反应。
除了直接的细胞毒性，C. difficile利用群体感应系统——特别是LuxS/AI-2和Agr——来根据群体密度协调集体行为，包括毒素合成、生物膜形成和孢子形成。Agr系统利用自诱导肽创建正反馈环，放大毒素基因表达。该系统的关键性得到证据支持，表明agrA突变持续导致致病性减弱和主要毒素TcdA、TcdB产量显著降低。
对抗生素治疗的显著耐药性和CDI的高复发频率主要归因于该菌形成弹性孢子和生物膜的能力。这些结构为营养细胞提供了物理庇护所，使其免受免疫介导的清除和抗菌剂的影响。此外，生物膜不仅仅是惰性屏障；它们作为代谢活跃的生态位发挥作用，其中群体感应信号和应激反应通路上调，从而即使在面对环境挑战时也能增强细菌的持久性。
1.1.3. 群体感应、群体淬灭与潜在靶点
在控制C. difficile毒力的复杂机制中，通过群体感应进行的细胞间通信是协调毒素合成、孢子形成和生物膜形成等集体行为的关键因素。该病原体主要采用两种主要的群体感应系统——LuxS/AI-2和Agr——它们以群体密度依赖性方式调节不同的转录程序。
LuxS系统产生通用信号分子自诱导剂-2（AI-2），在调节胞外基质生产和增强细菌在挑战性肠道环境中的持久性方面发挥关键作用。Agr系统则利用自诱导肽创建正反馈环，放大毒素基因表达。该系统的关键性得到证据支持，表明agrA突变持续导致致病性减弱和主要毒素TcdA、TcdB产量显著降低。
与之直接相反，群体淬灭（QQ）机制通过干扰或降解这些信号分子，代表了一种有前景的治疗和工业策略。QQ通过多种方式运作：可以是酶促的，采用切割AI-2或肽自诱导剂的内酯酶和酰基转移酶；也可以通过竞争性受体抑制和产生拮抗代谢物来运作。通过破坏这种细菌串扰，这些过程有效抑制毒素表达、破坏生物膜稳定性并限制孢子形成，从而共同降低C. difficile的毒力和复发可能性。
这种方法的转化潜力得到了近期体外和动物研究（2021-2024年）的有力支持，这些研究表明，像嗜酸乳杆菌和长双歧杆菌这样的原生益生菌可以自然下调关键毒力基因（luxS, tcdA, tcdB）并降低AI-2活性。这些发现提供了令人信服的证据，表明靶向微生物QQ活性为直接抗生素压力提供了可行且可持续的替代方案。
这些QS和QQ通路的多组学表征对于确定控制C. difficile的精确分子靶点至关重要。基因组学和代谢组学数据集一致地将LuxS/AI-2和Agr系统确定为关键调控枢纽，直接将病原体的代谢状态与其毒力输出联系起来。此外，蛋白质组学分析提供了机制性理解，证明具有QQ活性的共生菌株可以抑制关键的孢子形成起始因子Spo0A及其下游σ因子级联反应，从而直接降低孢子形成效率。
1.1.4. 益生菌、下一代益生菌、基因编辑、细菌联合体与活体生物治疗产品
通过益生菌和微生物联合体调节C. difficile毒力的策略已经经历了从经验性补充到机制驱动的生物技术的显著进化。传统益生菌，如嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌和副干酪乳杆菌等菌株，通过多方面的作用展示了其价值，例如竞争粘附位点、分泌抗菌化合物（如有机酸和细菌素）以及调节宿主粘膜免疫反应。
然而，超越这些定植抗性的一般机制，现代多组学研究揭示了一种更靶向的能力：特定的益生菌物种可以直接干扰C. difficile的核心毒力网络，导致毒素表达、孢子形成和生物膜形成的可测量减少。合成生物学与代谢工程的融合极大地扩展了这一治疗前景。这些学科现在使得能够设计执行靶向治疗功能的益生菌底盘菌株，包括分泌QQ酶、精确转化胆汁酸以及优化SCFAs的生物合成。
设计型微生物联合体提出了一种通过协调代谢活动来减轻C. difficile毒力的有前景的方法。超越协同相互作用，此类联合体的有效设计必须考虑代谢分工、营养竞争以及在波动的肠道条件下维持长期群落稳定性。在这方面，功能专业化——不同的菌株执行互补的角色，如次级胆汁酸转化、SCFA生产和群体淬灭——可以提高系统鲁棒性，同时减少对共享底物的直接竞争。
工程化或定义微生物联合体的长期功能性取决于其承受宿主介导的选择压力（如免疫监视、胆汁酸梯度、饮食变异性）的能力。忽视这些因素可能导致菌株丢失、代谢谱改变或治疗可靠性降低。因此，微生物联合体的合理设计越来越多地结合基因组尺度代谢模型、通量平衡分析和纵向组学监测，以在临床应用前预测竞争限制并优化功能专业化。
尽管基于QQ的策略在概念上具有吸引力并在实验中显示出效力，但积累的证据表明，在不同生物背景下，破坏QS通路并不总是导致稳健的抗毒力效应。多项体外和体内研究报告了毒素产生、生物膜形成或孢子形成的部分、菌株依赖性或不稳定的减少，强调仅靠QS干扰可能不足以在复杂肠道生态系统中有效抑制C. difficile致病性。
1.1.5. 合成生物学与精准工程在微生物组治疗中的应用
合成生物学、代谢工程和系统微生物学的融合正在从根本上重新定义基于微生物组的治疗前景。通过将遗传可编程性与多组学见解相结合，研究人员现在能够构建能够
