HTT1a蛋白在亨廷顿病基因敲入小鼠模型中启动HTT聚集的关键作用

《Brain》：The HTT1a protein initiates HTT aggregation in a knock-in mouse model of Huntington’s disease

本研究针对亨廷顿病中体细胞CAG重复扩展如何引发神经病理的问题，通过CRISPR-Cas9技术删除Htt基因内含子1的隐性多聚腺苷酸化位点，构建HdhQ150ΔI小鼠模型。研究发现HTT1a蛋白是启动HTT聚集的关键因子，降低HTT1a水平可延迟聚集数月并维持生物标志物NEFL/BRP39(YKL40)正常水平，为HTT降低治疗策略提供新靶点。

　　

亨廷顿病是一种遗传性神经退行性疾病，其病因源于亨廷汀基因（HTT）外显子1中的CAG重复序列异常扩展。这种突变导致亨廷汀蛋白（HTT）产生过长的多聚谷氨酰胺链，使得突变蛋白易于错误折叠和聚集。特别值得注意的是，突变CAG重复序列在特定神经元和脑区会随年龄增长进一步扩展，这一现象被认为是疾病发病机制的第一步。近年来研究发现，当CAG重复序列扩展时，HTT前体mRNA内含子1中的隐性多聚腺苷酸化位点会被激活，产生提前终止的转录本HTT1a。该转录本编码的HTT1a蛋白具有高度聚集倾向和强致病性。由于CAG重复序列越长，HTT1a产生量越多，一个重要科学问题随之产生：HTT1a的产生是否就是体细胞CAG重复扩展发挥致病作用的机制？这一问题的解答对设计降低亨廷汀水平的治疗策略至关重要。

为探究这一问题，研究团队在亨廷顿病基因敲入小鼠模型中采用CRISPR-Cas9技术阻止HTT1a的产生。研究人员从Hdh^Q150小鼠的Htt内含子1中删除所有潜在隐性多聚腺苷酸化位点，成功建立了两种小鼠品系：一种在突变等位基因上携带内含子1缺失的杂合子（Hdh^Q150ΔI），另一种在野生型等位基因上携带缺失的杂合子（WTΔI）。两个品系的CAG重复大小匹配良好，均约为195个CAG重复。

正如预测那样，删除Htt内含子1中的隐性多聚腺苷酸化位点确实阻止了Hdh^Q150ΔI小鼠中Htt1a转录本的生成。然而，研究人员仍检测到极低水平的HTT1a蛋白，这是由Htt外显子1和外显子2的读通产物所致，该产物保留了被删除的内含子，并在内含子2的隐性多聚腺苷酸化位点终止。研究对Hdh^Q150、Hdh^Q150ΔI、野生型和WTΔI小鼠进行了长达17个月的观察。

免疫组织化学和均相时间分辨荧光分析显示，Hdh^Q150和Hdh^Q150ΔI大脑中的HTT聚集物均含有HTT1a，但Hdh^Q150ΔI大脑中可溶性HTT1a水平的显著降低使聚集HTT1a的出现延迟了数月。尽管这种聚集病理的延迟仅部分逆转了转录失调，但在17月龄的Hdh^Q150ΔI小鼠中，生物标志物NEFL和BRP39（YKL40）仍保持在野生型水平。

主要技术方法：

研究采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Hdh^Q150ΔI小鼠模型，通过免疫组织化学和均相时间分辨荧光（HTRF）分析检测HTT聚集，使用Hdh^Q150基因敲入小鼠模型（CAG重复约195次）进行长达17个月的纵向观察，并评估NEFL/BRP39(YKL40)生物标志物水平。

研究结果：

HTT1a转录本生成被有效抑制

删除隐性多聚腺苷酸化位点后，Hdh^Q150ΔI小鼠大脑中几乎检测不到Htt1a转录本，证实该策略可有效阻断主要HTT1a产生途径。

低水平HTT1a蛋白的意外发现

通过蛋白质检测技术发现痕量HTT1a蛋白存在，经测序分析证实为Htt外显子1-2读通产物，该转录本保留了被删除的内含子1序列，并利用内含子2中的隐性多聚腺苷酸化位点完成转录。

HTT聚集时间显著延迟

尽管存在微量HTT1a，Hdh^Q150ΔI小鼠可溶性HTT1a水平大幅降低导致HTT聚集出现时间推迟数月，表明HTT1a是启动聚集过程的关键因子。

转录失调部分改善

虽然聚集病理延迟仅部分缓解转录失调现象，但重要神经丝蛋白轻链（NEFL）和乳腺癌相关蛋白39（BRP39/YKL40）生物标志物在17月龄突变小鼠中仍维持野生型水平。

研究结论与意义：

本研究首次证实HTT1a蛋白是启动亨廷顿病中HTT聚集过程的关键分子。尽管完全消除HTT1a面临技术挑战（如读通转录本的存在），但显著降低其水平已能有效延迟疾病病理进程。这一发现为亨廷顿病治疗策略提供了重要方向：针对HTT1a的特异性干预可能比广泛降低HTT水平更具治疗价值且安全性更高。研究结果强调在未来亨廷汀降低治疗策略中，需要特别关注HTT1a这一高度致病性亚型的特异性靶向，为开发更精准的亨廷顿病治疗方法奠定了理论基础。该研究发表于《Brain》杂志，为理解亨廷顿病发病机制和开发治疗策略提供了重要科学依据。