将 RFantibody 技术与分子动力学相结合，以发现针对登革病毒 NS3 蛋白酶的高亲和力纳米抗体抑制剂

《Computational and Theoretical Chemistry》：Integrating RFantibody and molecular dynamics to discover high-affinity Nanobody inhibitors targeting dengue virus NS3 protease

AI驱动的纳米抗体设计结合分子动力学模拟，成功筛选出靶向登革病毒NS3蛋白酶的高亲和力抑制剂，其中复合16、40、78的结合自由能达-50 kJ/mol，显著优于参考复合物，为开发新型抗病毒疗法提供依据。

　　

袁崇军|穆罕默德·阿里夫·穆罕默德·拉蒂夫|莫哈末·巴西亚鲁丁·阿卜杜勒·拉赫曼|比莫·A·特霍

马来西亚普特拉大学理学院化学系，43400，塞尔当，马来西亚

摘要

由于缺乏有效的抗病毒药物以及现有疫苗的效果有限，登革热仍然是一个重大的全球健康挑战。登革病毒NS3蛋白酶在病毒复制中起着至关重要的作用，并且在不同的血清型中高度保守，因此成为了一个有吸引力的药物靶点。在这项研究中，我们首先使用RFantibody（一种基于人工智能（AI）的单域抗体设计框架）生成了100个针对NS3蛋白酶催化三联体（His51、Asp75、Ser135）的纳米抗体候选物。这些复合物的结合亲和力通过PRODIGY软件进行了预测。根据预测结果，排名前六的纳米抗体-蛋白酶复合物被选中进行进一步评估，其中五个复合物使用GROMACS软件成功进行了100纳秒的分子动力学模拟。稳定性、紧凑性和氢键分析表明，大多数设计的纳米抗体复合物保持了稳定的构象，并且形成的氢键数量比参考的NS3-阿普罗丁蛋白酶复合物更多。使用MM/GBSA方法计算的结合自由能表明，几个设计的纳米抗体（特别是复合物16、40和78）表现出比参考复合物更强的结合能（约-50 kJ/mol）。通过残基能量分解和丙氨酸扫描，我们确定了互补决定区（CDRs）中的关键残基，这些残基通过疏水作用和氢键相互作用显著促进了结合。总体而言，我们的结果表明，将AI驱动的纳米抗体设计与分子模拟相结合可以有效地识别出高亲和力的登革病毒NS3蛋白酶抑制剂，为开发新型抗病毒治疗药物提供了有前景的策略。

引言

登革热是一种由登革病毒（DENV）引起的病毒性传染病，该病毒属于黄病毒科。它主要由埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）传播[1]。目前，这种疾病在全球100多个国家流行，受影响的地区包括非洲、美洲、东地中海、东南亚和西太平洋[2]。流行病学模型估计，每年全球约有3.9亿人感染登革病毒，其中约9600万人出现明显症状[3]。这些症状从轻微的发热（称为登革热DF）到更严重的形式如登革出血热（DHF）和登革休克综合征（DSS）不等[4],[5]。尽管登革热对全球公共卫生构成持续威胁，但目前医学界仍没有有效且广泛认可的登革热治疗方法或疫苗。

DENV含有一个正链单链RNA基因组，该基因组编码一个前体多聚蛋白，该多聚蛋白进一步被切割成三种结构蛋白（衣壳、前体膜和包膜）以及七种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）[6]。虽然登革病毒有四种血清型（DENV1–4），但NS3蛋白酶在黄病毒中高度保守，并且作为病毒蛋白酶起着关键作用，使其成为重要的药物靶点[7],[8]。NS3蛋白酶的催化三联体（His51、Asp75和Ser135）在黄病毒中高度保守，在底物识别和前体多聚蛋白切割中起着关键作用[9]。结构研究表明，包含这些催化残基的NS3蛋白酶活性位点在所有四种登革病毒血清型中都非常相似，表明其催化机制是保守的[10]。此外，作为辅因子，NS2B通过其β-发夹结构围绕NS3蛋白酶的催化核心发生构象变化，从而优化了底物结合口袋的动态特性并显著提高了该蛋白酶复合物的水解效率[11]。这种丝氨酸蛋白酶（NS2B-NS3）负责切割前体多聚蛋白中的多个位点（NS2A/NS2B、NS2B/NS3、NS3/NS4A和NS4B/NS5），生成对病毒复制至关重要的功能蛋白[12],[13],[14]。鉴于NS2B-NS3蛋白酶在病毒复制中的关键作用，它已成为开发抗登革热抗病毒抑制剂的重要靶点。

目前，还没有有效的疫苗或抗病毒药物可用于预防或治疗登革热。尽管几种针对病毒不同部分的候选药物（如celgosivir、balapiravir、氯喹和泼尼松）已经进入临床试验，但它们在临床试验中均未显示出对登革病患者的明显益处[15],[16],[17],[18]。市场上首个获批准的登革热疫苗是Chimeric Yellow Fever Dengue-Tetravalent Dengue Vaccine（CYD-TDV），由赛诺菲巴斯德公司开发，这是一种减毒重组四价活疫苗。它由四种基于黄热病疫苗17D骨架的减毒重组活疫苗（CYD-1-4）组成，每种疫苗分别表达四种登革病毒血清型中的一种的前体膜和包膜基因[19]。目前，该疫苗已在登革热流行区和非流行区的6000多名儿童和成人中接种，所有已完成或进行中的试验均未报告安全问题[20]。然而，对于从未感染过登革热的人，该疫苗的效果较差[21]。由于疫苗不包含病毒的非结构蛋白，研究人员越来越关注这些蛋白在对抗登革病毒免疫反应中的作用[21]。当前预防和治疗方法的局限性凸显了迫切需要新的登革病毒治疗策略。

传统的药物发现过程在进入临床开发阶段之前既耗时又昂贵，这使得新治疗药物的发现成为一项具有挑战性和高成本的努力[22]。人工智能（AI）驱动的方法为显著改进历史上成本高昂的药物设计过程提供了有希望的途径，特别是随着生成模型在从头药物设计中的广泛应用，这些模型专注于从零开始创建全新的生物化合物[23]。与其他从现有化学库中筛选类似药物的机器学习方法不同，从头药物设计通过探索广阔的未知化学空间并从零开始生成类似药物的候选物来规避这些固有限制[24],[25],[26]。像RFdiffusion、ProteinMPNN和RoseTTAFold2这样的生成模型通过预测蛋白质骨架、为特定结构设计序列以及直接从氨基酸序列预测蛋白质结构，推动了计算蛋白质设计的发展[27],[28],[29]。Baker实验室开发了RFantibody，这是一种从RFdiffusion改进而来的工具，用于设计保持抗体结构的支架，并实现单域抗体（VHHs）的从头设计[30]。这种方法允许在不进行免疫或库筛选的情况下设计针对抗原表位的纳米抗体支架。

在这项研究中，我们旨在使用RFantibody设计出结合亲和力高于阿普罗丁蛋白酶的纳米抗体抑制剂。首先，我们应用RFantibody中的从头设计工作流程生成了100个候选纳米抗体-NS3复合物进行筛选。然后使用PRODIGY软件预测了这些复合物以及参考复合物3U1J（NS3-阿普罗丁蛋白酶）的结合亲和力[31]。根据预测的亲和力，选择了表现优于3U1J的前六名纳米抗体-NS3复合物进行分子动力学模拟，以进一步评估其稳定性和结合特性。模拟结果显示，从头设计的纳米抗体复合物通常表现出比参考复合物更强的结合亲和力。残基级别的能量分解表明，纳米抗体的互补决定区（CDRs）为结合提供了有利的能量贡献。总体而言，这项研究表明，RFantibody支持的头设计可以生成具有更高结合亲和力和稳定性的纳米抗体抑制剂，表明它们作为针对NS3蛋白酶的潜在候选物具有后续实验验证的潜力。

部分摘录

通过RFantibody生成候选纳米抗体复合物

设计高亲和力纳米抗体以靶向登革病毒NS3蛋白酶的工作流程始于从蛋白质数据库（https://www.rcsb.org/）获取的DENV3 NS3蛋白酶的高分辨率结构（PDB ID：3U1J）[32]。然后使用Swiss-PdbViewer修复了蛋白结构中的E链（阿普罗丁蛋白酶）。修复后的复合物作为我们设计策略的第一阶段的输入结构。

候选纳米抗体复合物的生成和结合亲和力分析

补充材料表S1包含了RFantibody生成的100个候选纳米抗体复合物的结构和序列数据：预测的对齐误差（PAE）、抗体框架与起始结构的均方根偏差（RMSD）以及各自的序列。PAE是评估预测结构置信度和结合可能性的关键指标，PAE值低于10 ?通常表示成功的相互作用。

结论

在这项研究中，我们将AI驱动的纳米抗体设计与分子动力学模拟相结合，以识别潜在的登革病毒NS3蛋白酶抑制剂。使用RFantibody生成了一组纳米抗体候选物，并进行了系统筛选，从而鉴定出几种在长时间尺度模拟中表现出稳定结合模式和有利界面相互作用的候选物。MM/GBSA分析进一步表明，多个设计的

CRediT作者贡献声明

袁崇军：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、形式分析。穆罕默德·阿里夫·穆罕默德·拉蒂夫：撰写——审稿与编辑、监督、形式分析。莫哈末·巴西亚鲁丁·阿卜杜勒·拉赫曼：撰写——审稿与编辑、监督、形式分析。比莫·A·特霍：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、监督、方法学、资金获取、形式分析、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了马来西亚普特拉大学的资助（项目编号：GP-IPS/2023/9747200）。