《Food Bioscience》：Yeast extract-mediated bidirectional regulation of off-odor binding to myofibrillar protein: Mechanisms for off-odor control in surimi products
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紫外-室温等离子体联合诱变提高 Paenibacillus ehimensis HD 菌株抗菌肽（AMPs）产量，外源 L-赖氨酸和 L-天冬酰胺通过调控碳水化合物、糖酵解等代谢通路促进菌株生长及 AMPs 合成，其中 L-天冬酰胺显著提升产物浓度。
冯成玲|张家佩|司云飞|赵振|宁亚伟|王志新
河北科技大学食品与生物学院，中国石家庄市玉祥街26号，050018
摘要
抗菌肽（AMPs）作为一种新型抗菌产品，在食品、医药等领域具有广泛的应用前景。我们研究小组之前鉴定出一种Paenibacillus ehimensis HD菌株，发现该菌株合成的抗菌肽稳定性高且抗菌谱广。为了提高抗菌肽的产量，本研究采用了紫外-常压室温等离子体（UV-ARTP）诱变技术对P. ehimensis HD进行改造。这一方法显著提高了抗菌肽的产量。随后，通过静息细胞培养系统和非靶向代谢组学分析发现，添加L-赖氨酸（Lys）或L-天冬酰胺（Asn）有利于P. ehimensis HD 8-3的生长，其中天冬酰胺还能增强抗菌肽的产量。在P. ehimensis HD 8-3的快速生长阶段，添加这两种氨基酸后，与碳水化合物代谢、糖酵解途径、TCA循环、戊糖磷酸途径（PPP）和氨基酸代谢相关的代谢物上调，为菌株生长或抗菌肽合成提供了前体和能量。这些结果表明，适当添加外源Lys和Asn是提高P. ehimensis HD 8-3抗菌肽产量的有效策略。
引言
抗菌肽（AMPs）是一类具有广泛抗菌活性的生物活性多肽，能够有效抑制细菌、真菌和病毒。它们主要来源于细菌、动物、真菌和植物，也可通过蛋白质水解获得（Bin Hafeez等，2021；Bucataru & Ciobanasu，2024）。抗菌肽的作用机制多样，包括破坏细胞膜、干扰核酸和蛋白质合成、调节酶活性等，并且对人体具有低毒或无毒性，这使得它们难以产生耐药性（Li等，2022；Luo & Song，2021）。因此，抗菌肽在食品保存、临床治疗、动物饲料添加剂和生物制药等领域有广泛应用（Huan等，2020；Moretta等，2021）。微生物是抗菌肽的重要来源，它们具有多种结构和抗菌活性，为抗菌肽的合成提供了经济高效且可持续的途径（Chen等，2024）。其中Paenibacillus属菌株因其能够产生活性强、抗菌谱广且耐药性低的抗菌肽而备受关注。例如，P. ehimensis B7已被证实能产生环状脂肽抗生素（Chen等，2019；Huang等，2013）。Paenibacillus属菌株还产生多种抗菌肽，如Paenibacillus polymyxa OSY–EC产生的多粘菌素E、Paenibacillus polymyxa JSa-9产生的AMP-jsa9以及Paenibacillus sp. SMB1T产生的杆菌肽A（Abdelhamid等，2022；Han等，2017；Singh等，2019）。我们之前的研究中发现了一种Paenibacillus ehimensis HD菌株，它能产生稳定性高、溶血活性低且抗菌谱广的抗菌肽ehimensins。该菌株还产生了新的抗菌脂肽ehimensins F4、F5和F6，对Candida albicans生物膜和Penicillium expansum具有显著的抑制作用（Feng等，2023；Huang等，2025）。
大多数野生Paenibacillus属菌株的抗菌肽产量较低，难以满足商业化需求，限制了其广泛应用。因此，随着对抗菌肽需求的增加，迫切需要通过多种策略提高其产量。近年来，提出了多种提高抗菌肽产量的技术，如培养基优化、菌株随机诱变和代谢工程（Dang等，2019）。通过紫外线（UV）、常压室温等离子体（ARTP）、亚硝基胍和辅助乙基甲磺酸等诱变方法，可以引起菌株的基因型和表型改变（Fang等，2024；Kortam等，2023；Zhao等，2023）。例如，Sun等（2024）利用UV-ARTP联合诱变技术培育了木质素降解菌株，使JC-28-UA12稳定突变体的木质素降解能力提高了16.18%。Yu等（2024）通过UV-ARTP联合诱变方法将大环内酯类化合物的产量提高了3.95倍。与传统单一诱变方法相比，本研究开发了一种新的UV-ARTP复合诱变技术，能够产生更广泛的突变谱，有助于高效分离出改良菌株P. ehimensis HD 8-3。此外，发酵优化也是提高微生物抗菌肽产量的传统方法，合适的培养基成分能显著促进细菌发酵。氨基酸作为抗菌肽的组成单元，在培养基中具有独特的促进作用。Liu等（2023）优化了Bacillus amyloliquefaciens HM618的培养基，通过添加鸟氨酸显著提高了肽的产量，因为鸟氨酸参与表面活性肽的合成。Chen等（2022）向培养基中添加外源L-缬氨酸，得到了具有广谱抗菌活性、高稳定性和低溶血活性的抗菌肽。多项研究表明氨基酸对抗菌肽合成有显著调控作用，但关于氨基酸促进抗菌肽合成机制的研究仍有限。本研究进一步探讨了外源氨基酸补充对提高抗菌肽产量的效果，采用静息细胞培养系统和非靶向代谢组学分析方法，确定了氨基酸添加后上调的具体代谢组分，从而阐明了它们在促进抗菌肽生物合成中的作用。
抗菌肽的合成主要通过两条途径实现：核糖体途径依赖遗传编码和翻译，而非核糖体途径则利用模块化的非核糖体肽合成酶（NRPS）。NRPS通过流水线方式组装氨基酸（包括非蛋白质来源的氨基酸）。这一系统能够实现多种结构修饰，是微生物合成复杂肽类（如脂肽）的关键机制（Baltz等，2021；Iacovelli等，2021；Ranjan等，2023）。抗菌肽的生物合成涉及多种代谢途径，如中心碳代谢和氨基酸代谢等（Elbediwi & Rolff，2024）。研究这些途径相关的细胞内代谢物变化对于揭示抗菌肽合成关键因素至关重要。代谢组学可以提供关于细胞内代谢物的全面视图，揭示微生物在环境变化下的生化反应网络和代谢机制（Bhosle等，2022）。例如，比较代谢组学分析成功探讨了野生型S. nodosus ZJB20140315（AmB产量低）与突变株S. nodosus ZJB2016050（AmB产量高）之间的细胞内代谢差异（Zhang等，2021）。Long等（2024）对野生型与突变株进行了比较代谢组学分析，发现< />基因的缺失可通过调节全局代谢途径促进红色色素的合成。Thiostreptamide S4是一种核糖体合成并经过翻译后修饰的肽（RiPP），属于具有良好抗肿瘤特性的硫胺类化合物。Eyles等（2021）利用非靶向代谢组学与靶向前体肽诱变技术，在异源宿主中改造了Thiostreptamide S4的生物合成基因簇（BGCs），阐明了其合成途径，为未来RiPP的发现和工程化提供了基础。
本研究建立了一种结合UV和ARTP的复合诱变技术，获得了高产抗菌肽的菌株P. ehimensis HD 8-3。为消除细菌生长带来的干扰，采用静息细胞培养系统精确评估外源氨基酸补充对抗菌肽合成的直接影响，从而进行准确的表型筛选。基于静息细胞系统的筛选结果，进一步利用非靶向代谢组学系统系统地揭示了关键促进因子（如赖氨酸和天冬酰胺）在全局代谢水平上的作用机制，明确了这两种氨基酸在P. ehimensis HD 8-3中调节抗菌肽合成的关键代谢途径。
菌株、试剂和培养基
Paenibacillus ehimensis HD菌株是从土壤中通过实验室工作获得的。指示菌株Staphyloccocus aureus ATCC 25923和Penicillium chrysogenum ATCC 10106则来自中国工业微生物菌种保藏中心（北京）。
种子培养基（NB液体培养基）含有5.0 g/L NaCl、3.0 g/L牛肉提取物和10.0 g/L蛋白胨，pH值为7.5；固体培养基（NA培养基）添加了17.0 g/L琼脂。发酵培养基中包含甘露醇（2.5
高抗菌活性突变的筛选与验证
为了进一步提高P. ehimensis HD的抗菌肽产量，采用UV与ARTP联合诱变技术构建了突变体文库。经过UV诱变后，获得了15个突变株，并测定了这些突变株产生的抗菌肽的抗菌活性。如图1a所示，其中HD 3-5、HD 3-1和HD 1-7三个突变株的抗菌活性显著高于原始菌株P. ehimensis HD（291.55 AU/mL）
讨论
生长迅速且易于培养的微生物是天然抗菌肽的重要生产者。在我们的实验室中，分离出了一种能够合成抗菌肽的P. ehimensis HD菌株。该菌株产生的抗菌肽具有广谱抗菌性，能有效抑制多种细菌和真菌，并且不具有溶血性。这些特性使其在草莓保鲜研究中得到了应用。然而，也存在一些局限性
结论
本研究采用UV和ARTP联合诱变技术获得了P. ehimensis HD 8-3突变株，其抗菌肽产量比原始菌株提高了1.54倍。同时，研究了多种外源氨基酸对P. ehimensis HD 8-3生长和抗菌肽产量的影响以及代谢变化。结果表明，外源Lys和Asn可以促进生物量增加，其中天冬酰胺显著促进了抗菌肽的合成。
作者贡献声明
宁亚伟：资源获取。王志新：写作——审稿与编辑、资金申请、数据分析、概念构思。司云飞：数据分析。赵振：数据管理。冯成玲：初稿写作、数据分析、概念构思。张家佩：初稿写作
未引用参考文献
Lebedeva等，2021。
利益冲突
作者声明不存在利益冲突。
利益声明
作者声明没有竞争性财务利益。
数据可用性
本研究生成或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。
资助
本研究得到了河北省自然科学基金（编号C2020208014）和河北省科技计划（编号22327107D）的支持。
利益声明
作者声明没有竞争性财务利益。
