《Food Bioscience》：Untargeted Metabolomics-Based Investigation of Amino Acid Effects on Antimicrobial Peptides Production in
Paenibacillus ehimensis HD 8-3 Fermentation
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控制海鲜异味的关键在于优化蛋白质与异味分子的相互作用机制。本研究发现酵母提取物（YE）通过改变肌原纤维蛋白（MP）的三级结构实现双向调控：低浓度YE（0.5%）促进MP unfold，增强疏水、静电和氢键作用，提高异味结合容量；高浓度YE（2%）因自身含硫化合物竞争结合位点，导致MP结构松散化，削弱异味结合能力。分子动力学模拟证实YE中精氨酸（L-Arg）与MP酸性残基的静电作用，以及谷氨酸（L-Glu）与MP精氨酸、色氨酸、丙氨酸的多类型相互作用，是引发MP构象变化的关键机制。该研究为清洁标签异味调控提供了新策略。
丹武|钟阳仁|吴丹才|建雄|库莉|裴莉|严张|麒麟黄
集美大学海洋食品与生物工程学院，中国厦门361021
摘要
控制异味对于提高鱼糜产品的感官质量和消费者接受度至关重要。在本研究中，创新性地应用了酵母提取物（YE）来调节/控制鱼糜产品中的异味释放。在两阶段加热过程中，监测了添加0%-2% YE后肌原纤维蛋白（MP）的结构变化及其异味结合能力。值得注意的是，YE引起的MP结构变化影响了其对异味的结合能力，表现出双向调节效应：低添加量（0.5%）时结合能力增强，而高添加量（2%）时结合能力减弱。低添加量的YE促进了蛋白质的展开，增加了结合位点的数量，并增强了MP与异味之间的结合力（疏水相互作用、静电相互作用和氢键），从而抑制了异味的释放。然而，过量的YE会导致其自身的芳香化合物与异味化合物竞争MP上的结合位点，从而在加工过程中促进异味的释放。分子动力学模拟表明，YE中的L-Arg通过静电相互作用与MP上的酸性氨基酸残基结合，而富含L-Glu的YE则通过静电、离子-偶极和氢键与MP上的Arg、Tyr和Ala残基相互作用，从而导致MP的结构-功能变化。分子对接进一步揭示了YE中的L-Arg和L-Glu引起的MP结构变化对其与异味化合物结合能力的影响。本研究阐明了YE对异味结合能力双向调节的作用机制，并揭示了YE中带电氨基酸的关键作用，为鱼糜加工中的异味控制提供了一种环保的解决方案。
引言
银鱼（Hypophthalmichthys molitrix）是全球最普遍的淡水鱼类之一，富含高质量的营养蛋白质，可以制成优质的鱼糜（Zhang等人，2020a；Zhang等人，2020b；Zhang等人，2020c；Zhang等人，2020d）。然而，由于养殖、加工或储存过程中的环境因素、脂质氧化、蛋白质降解和微生物降解，银鱼容易产生难闻的异味（Xue等人，2023）。银鱼鱼糜中的异味化合物主要是醛类、醇类、酮类、氮化合物和硫化合物，这些化合物具有草味、鱼腥味、油味或木味，导致鱼糜具有令人不悦的气味，降低了消费者的接受度（An等人，2022；Huang、Yin、Xiong和Huang，2024）。食物风味的感知涉及三个主要阶段：风味的形成、风味从食物基质中的释放以及嗅觉受体对风味的感知（Wang等人，2024）。因此，可以通过三种方式抑制异味：减少异味的产生、抑制异味的释放以及减弱对异味的感知。历史上，人们采用了抗氧化剂（防止脂质氧化）或物理脱臭等方法，但这些方法在效率和残留效应方面仍存在挑战（表1）。与这些方法相比，通过食物基质本身调节异味物质的释放是一种更直接、可持续的控制产品质量的方法。肌原纤维蛋白（MP）是鱼蛋白的主要成分，本身无气味，但可以通过共价或非共价相互作用结合异味物质，从而影响异味物质的结合和释放（Anantharamkrishnan、Hoye和Reineccius，2020；Wu、Cao、Yin和Huang，2024）。非共价相互作用指的是异味物质与蛋白质极性基团之间的可逆相互作用，如疏水相互作用、氢键和静电相互作用，这些作用可以用来调节异味物质在食物基质中的保留和释放（Bi等人，2022）。疏水相互作用通常发生在蛋白质的内部疏水区域，可以选择性地结合醛类、酮类、醇类和酯类等异味物质（Zhang、Kang、Zhang和Lorenzo，2021）。像脂肪醇和挥发性羧酸这样的异味物质倾向于通过氢键与蛋白质的巯基结合，而内酯则与羧基形成双氢键桥（Wang等人，2022a；Wang等人，2022b；Wang等人，2022c）。这种固有的结合特性使MP成为调节食物基质中异味释放的关键目标，提供了一种不同于预防或掩盖的“捕获和保留”策略。然而，这些相互作用容易受到蛋白质构象和外部因素（如热处理、pH值、离子强度和外源添加剂）的影响（Xu等人，2021）。
酵母提取物（YE）是一种天然调味品，以酵母为原料，利用现代生物技术降解酵母细胞中的核酸和蛋白质制成（Pancrazio等人，2016）。它具有多种功能，不仅含有氨基酸、核苷酸、肽和微量元素，还富含芳香化合物，从而改善食物风味或掩盖不愉快的气味。带电氨基酸可以与蛋白质上的氨基酸残基相互作用，改变其结构（Yuan等人，2021）。Chen等人（2016）发现组氨酸改变了肌球蛋白杆区的三级结构，降低了其α-螺旋含量，这归因于组氨酸上的咪唑基团。Shi等人（2021）证明L-Arg使肌球蛋白分子的有序二级结构（尤其是β-折叠）消失，从而形成更松散的蛋白质结构，抑制了热诱导的肌球蛋白聚集。此外，我们的先前研究表明，YE还能改善银鱼鱼糜的凝胶特性，这主要归因于其中的带电氨基酸（Wu、Xiong等人，2024）。后续结果还显示，YE显著降低了鱼糜凝胶中以醛类为主的异味化合物含量（表S1）。然而，YE调节MP结构及其与异味物质结合亲和力的具体机制尚不清楚，这阻碍了YE作为食品成分的广泛应用。因此，本工作的创新之处在于系统地揭示了从添加YE到实际热处理过程中MP构象变化，再到最终异味结合结果的因果链。在制备鱼糜凝胶时，通常采用两阶段加热方法（40°C加热30分钟和90°C加热30分钟）来获得高质量凝胶。在低温加热（40°C）下，蛋白质的分子结构逐渐展开，暴露出原本埋藏在分子内部的疏水基团。在高温加热（90°C）下，蛋白质结构完全展开并迅速变性，由于疏水相互作用导致不可逆的聚集（Guo等人，2015；Qi等人，2018）。为了准确模拟实际鱼糜生产过程，本研究调查了YE在两阶段加热过程中对MP与异味化合物结合能力的影响。
本研究探讨了YE对MP溶解度、表面疏水性、聚集大小和形式以及加热过程中三级结构的影响。此外，基于我们之前的发现，选择了八种典型的异味化合物（包括七种醛类和一种醇类），使用SPME-GC技术研究了YE对加热过程中MP与异味化合物结合能力的影响。接下来，通过拟合Hill方程利用SPME-GC数据明确了MP与庚醛的结合位点和结合力，并使用各种化学试剂详细研究了MP与庚醛之间的结合类型。最后，通过分子动力学模拟验证了YE中带电氨基酸对MP结构及其与异味化合物结合能力的影响，并通过分子对接探讨了YE中的挥发性化合物与肌球蛋白的结合模式。本研究旨在为将YE作为多功能、环保的鱼糜加工异味控制成分提供机制基础。
样本和化学品
活银鱼（重量2.5 ± 0.5公斤）从华中农业大学的超市购买，并用充氧袋运输到实验室。YE（KU012）由湖北宜昌的Angel Yeast Co., Ltd提供。异味标准品为色谱级，购自上海的Aladdin。本研究中使用的其他所有化学品均为分析级。
YE对MP溶解度的影响
溶解度与蛋白质-水和蛋白质-蛋白质之间的相互作用密切相关，如偶极-偶极力和离子-偶极力、疏水相互作用和二硫键（Zhang等人，2020a；Zhang等人，2020b；Zhang等人，2020c；Zhang等人，2020d）。图1（a）显示了两阶段加热后MP的溶解度变化，所有MP样品的溶解度均呈下降趋势。
结论
本文研究了YE对MP结构的影响以及加热过程中MP与异味化合物结合能力的变化。YE不仅将MP的溶解度从5.50%提高到14.55%，还促进了蛋白质链的展开。AFM观察结果表明，添加YE后MP的颗粒分布更加均匀，聚集体更小。这些由YE引起的结构变化直接体现在MP的
CRediT作者贡献声明
麒麟黄：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学、资金获取、概念构思。严张：监督。裴莉：研究。丹武：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、软件使用、方法学、研究、数据管理。库莉：资源提供、方法学。建雄：资源提供、方法学。吴丹才：方法学、数据管理。钟阳仁：方法学、研究、数据管理
未引用的参考文献
Alavi等人，2018；G和O.，2003；Wang等人，2023。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了中国国家重点研发计划（2021YFD2100105）和校企合作项目（2023-4201-13-000901）的支持。
