《Food and Chemical Toxicology》：Discovery of novel umami-enhancing peptides in enzymatic hydrolyzed walnut meal protein and evaluation of their umami-enhancing effect and mechanism
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核桃 meal 蛋白质水解物通过酶解优化和分离纯化获得，结合虚拟筛选和分子模拟确定11个鲜味增强多肽（DGFE, GPRAAP等），感官评价和电子舌证实其协同或叠加效应可提升MSG溶液鲜味强度15.22%-119.35%，延长持续时间20%-66.67%，分子机制显示其增强受体结合亲和力。
Cunchao Zhao|Yuwei Guo|Feng Zhang|Pimiao Huang|Yang Tian|Lijun You
华南理工大学食品科学与工程学院，中国广东省广州市五山路381号，510640
摘要
本研究评估了从核桃粉蛋白中提取的肽类增强鲜味感知的能力。通过单因素优化、超滤和乙醇沉淀法，制备出了具有显著鲜味强度的核桃粉蛋白水解物。随后采用综合虚拟筛选策略，获得了11种具有鲜味增强效果的候选肽类，并通过感官评价和电子舌技术对其效果进行了验证。在这些候选肽中，DGFE、GPRAAP、GDPGW和DDNFLDF肽类在味精（MSG）溶液（浓度分别为3 mg/mL、6 mg/mL和9 mg/mL）中添加后，使鲜味强度提高了15.22%至119.35%，同时延长了鲜味持续时间20.00%至66.67%，显示出协同或叠加效应。分子对接分析表明，这些肽类通过提高结合亲和力以及增加相互作用力的数量和多样性，增强了味精与T1R1/T1R3受体之间的结合，从而增强了鲜味感知。分子动力学模拟进一步证实了这些肽类在稳定和增强味精与T1R1/T1R3受体复合物结合中的作用。这些发现为开发可作为食品添加剂的鲜味增强肽提供了新的资源，并提升了核桃粉蛋白的利用价值。
引言
鲜味被认为是五种基本味觉之一，对食品风味评价具有重要影响。与鲜味相关的化合物能够提升食品的感官品质，改善口感和消费者接受度（Yang等人，2025年）。味精（MSG）被广泛用于调节食品中的鲜味特性（Chen等人，2023年）。然而，味精含有较高的钠含量，过量摄入可能与心血管疾病、高血压和重要器官损伤等健康问题相关（Le等人，2022年）。因此，人们越来越关注寻找天然、无害且低钠的鲜味替代品。近年来，由于鲜味肽的天然来源、安全性以及其在增强鲜味感知方面的有效性，它们受到了广泛关注（Xie等人，2023年）。酶法水解仍是生成鲜味肽的主要方法，目前动物源蛋白是主要的鲜味肽来源。然而，随着全球对动物蛋白需求的增加，以及对畜牧业环境、伦理和健康影响的担忧日益加剧，寻找可持续的蛋白来源变得尤为重要（Gu、Niu等人，2024年）。
核桃在中国广泛种植，云南和新疆是主要生产区。核桃粉是从核桃油提取过程中产生的副产品，保留了核桃的主要营养成分。通常，脱脂核桃粉的蛋白质含量超过40%。然而，核桃粉主要被用作动物饲料或被完全废弃，导致蛋白质资源的大量浪费（Wang等人，2023年）。研究表明，核桃粉蛋白（WMP）及其水解物（WMPH）具有多种生物活性，如抗氧化作用、调节脂质代谢以及影响肠道微生物群和粪便代谢物（Shen等人，2024年）。然而，关于利用核桃粉作为蛋白质来源生成鲜味肽的研究较少。鉴于核桃粉中含有丰富的鲜味相关氨基酸，它成为生产鲜味肽的理想底物。因此，从核桃粉中鉴定出鲜味肽不仅可以丰富天然增味剂的选择，还能提高核桃产业的经济效益和附加值。
传统的鲜味肽鉴定方法依赖于顺序分离、纯化、合成和感官验证，这一过程既耗时又费力（Li等人，2023年）。生物信息学的进步显著简化了这一过程。此外，包括iUmami-SCM、UMPred-FRL、Umami-YYDS和Umami-MRNN在内的机器学习模型已被成功应用于预测潜在的鲜味肽，提高了预测的准确性和效率（Gu、Niu等人，2024年；Zou等人，2024年）。利用这些方法已经从猪I型胶原蛋白（Gu、Zhang等人，2024年）、酵母蛋白（Gu等人，2025年）和大豆酱（Pan等人，2025年）等来源鉴定出了鲜味肽。因此，基于生物信息学的筛选方法在鲜味肽研究中的可信度和接受度不断提高。
对特定鲜味肽的感官评价至关重要。味觉感知是动态变化的，吞咽或吐出后残留的味觉刺激可能会持续存在。因此，需要足够的评估时间来准确捕捉味觉强度和持续时间的变化（Di Monaco等人，2014年）。例如，时间-强度（TI）方法提供了关于峰值味觉强度、最大味觉感知时间、味觉持续时间以及随时间变化的强度波动的宝贵数据（Huang、Liu等人，2024年）。同时，电子舌技术在味觉研究中显示出巨大潜力，因为它具有客观分析和无检测疲劳等优点。
本研究采用感官引导的方法制备了具有显著鲜味强度的核桃粉蛋白水解物，并通过综合机器学习模型和其他生物信息学工具鉴定出潜在的新鲜味肽。通过感官评价和电子舌分析评估了它们的鲜味增强效果。为进一步阐明其作用机制，进行了分子对接和分子动力学模拟。这些发现为开发源自可持续蛋白的新鲜味增强肽提供了理论基础，并为进一步探索核桃粉衍生的增味剂提供了方向。
材料
核桃粉蛋白由我们实验室制备，蛋白质含量为83.7%。甲酸和乙腈购自上海麦克林生化科技有限公司。11种肽类（YFDR、DDNFLDF、SFEFR、MYR、SDFF、GPRAAP、GGVDPSGPHL、GDPGW、VDGPGMKF、DSFF和DGFE）的纯度均超过98%，由位于中国的上海强耀生物科技有限公司合成。
核桃粉蛋白水解物（WMPH）的制备
WMPH的制备方法参考了以往的研究，并进行了一些改进（Gu，
WMPH的制备
蛋白酶具有不同的切割特异性，这对所需产物的生成有显著影响。因此，选择合适的蛋白酶对于酶促反应至关重要。在本研究中，评估了五种常用的商业蛋白酶（木瓜蛋白酶、胰酶、碱性蛋白酶、风味酶和Protamex），以制备WMPH（Kong等人，2019年）。在统一的水解条件下
结论
在优化条件下（底物浓度5%，风味酶添加量0.6%，pH值7.0，温度50°C，时间3小时），成功制备出了具有显著鲜味特性的WMPH。经过超滤和乙醇沉淀后，分子量低于3 kDa的EP3组分（使用60%乙醇沉淀获得）的鲜味强度显著增强。全面的肽谱分析从EP3组分中鉴定出了1846种肽，为后续的虚拟筛选提供了依据
作者贡献声明
Cunchao Zhao：撰写初稿、资源获取、项目管理、方法设计、数据分析、概念构思。Yuwei Guo：验证、软件使用、实验设计、数据分析。Feng Zhang：数据可视化、实验设计、数据管理。Pimiao Huang：数据可视化、验证、软件使用、资源管理、数据管理。Yang Tian：撰写、审稿与编辑、数据可视化、项目监督、资源管理、方法设计、数据分析。Lijun You：撰写、审稿
机构审查委员会声明
根据云南农业大学人类伦理委员会的监管指南，食品感官评价研究无需正式的伦理批准。所有实验程序均遵循《赫尔辛基宣言》中规定的伦理原则。每位评估者在参与感官评价前均签署了书面知情同意书。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了云南省建设南亚和东南亚科技创新中心-国际联合创新平台专项（202503AP140010）的支持。
