基于银纳米粒子和银纳米簇的比色/荧光双模块双价适配体传感器，用于检测卡那霉素

《Food Control》：Colorimetric/fluorescent dual-module bivalent aptasensor for kanamycin detection based on silver nanoparticles and silver nanoclusters

基于双价aptamer构建的银纳米颗粒/纳米团簇复合探针，实现kanamycin的高灵敏检测（荧光模式5.98 fM），结合颜色和荧光三模式检测，便携低成本，并成功应用于水产品检测。

　　

董旭|李星星|闫欣欣|单磊|李福厚|王伟霞|张玉成民|陈金瑞

江苏海洋大学海洋生物资源与环境重点实验室，中国海州仓梧路59号，222005

摘要

卡那霉素（KAN）的过量摄入对人类健康构成重大风险，因此需要开发快速、便携、低成本且高灵敏度的生物传感器来监测KAN。本文基于双价适配体模板化的银纳米颗粒（BApt-templated AgNPs）和双价适配体模板化的银纳米簇（BApt-AgNCs），通过cDNA-BApt-cDNA、NaBH₄和AgNO₃反应制备了一种用于快速检测KAN的比色/荧光双价适配体传感器。通过改变NaBH₄和AgNO₃与cDNA-BApt-cDNA的反应温度和时间，可以合成BApt-templated AgNPs和BApt-AgNCs。该适配体传感器具有比色/荧光双重检测模块，支持吸光度/RGB/荧光三种模式检测。在荧光检测模块中实现了5.98 fM的超低检测限，在比色检测模块中实现了0至500 μM的检测范围。同时，该适配体传感器在实际样品测试中表现出优异的重复性，因此在KAN的现场定量分析和便携式检测方面具有巨大潜力。

引言

卡那霉素（KAN）是一种强效的氨基糖苷类抗生素，通过抑制细菌细胞中核糖体蛋白的合成对病原菌具有显著的治疗效果（Li等人，2024年）。因此，它是生物医学、农业、畜牧业和食品工业的关键成分（Tian等人，2025年）。然而，新的毒理学证据表明，与其他氨基糖苷类抗生素相比，KAN的耳毒性和肾毒性显著增强，其毒性仅低于新霉素（Lee等人，2024年）。KAN的过量使用或长期治疗可能是儿童耳聋的主要原因（Li等人，2023年）。近年来，在水产品、乳制品和动物源性食品中越来越多地检测到KAN残留。一些样品的KAN残留量超过了欧盟设定的最大残留限。KAN残留不仅直接威胁消费者健康，还可能促进耐抗生素细菌的发展（Zhang等人，2026年）。因此，为了减少医疗治疗中KAN的过度使用并防止动物源性食品中KAN残留的积累，有必要监测KAN以确保医疗和食品安全。

迄今为止，已经开发了多种KAN检测技术，包括气相色谱（GC）（Preu等人，1998年）、高效液相色谱（HPLC）（Mays等人，1976年）、微生物分析（Guliy等人，2022年）、毛细管区电泳（Kaale等人，2001年）和免疫测定（Liu等人，2023年）。然而，这些技术实施起来具有挑战性，需要熟练的人员和复杂的样品制备过程（Chen等人，2024年）。因此，仍需要开发快速、高灵敏度、便携且低成本的KAN检测技术。

适配体由通过体外筛选获得的单链寡核苷酸序列或短链多肽组成。其显著特点是其对目标分子的极高亲和力和特异性（Canoura等人，2024年；Liu等人，2025年）。鉴于适配体具有易于合成、储存方便、亲和力高、特异性强和免疫原性低的优点，近年来越来越多的基于适配体的生物传感器（适配体传感器）被专门设计用于检测KAN（Duan等人，2023年；Gao等人，2022年）。然而，目前报道的KAN适配体传感器均基于单价适配体（Zhang等人，2025年；Wang等人，2026年），且这些适配体的实验程序相当复杂，因此仍有很大的改进空间。例如，一个完整的适配体可以分成两个部分，这有助于构建更复杂和高效的适配体传感器（Chen等人，2016年）。两个完整的适配体可以组合成一个双价适配体，以增强适配体的亲和力和特异性，这也已被证明是有效的（Jiang等人，2018年）。与单价适配体相比，双价适配体通过其双臂与目标分子上的两个表位结合，表现出更强的亲和效应。这不仅表现为更稳定的结合，还直接转化为更低的检测限和更快的响应时间。在保持单链DNA（ssDNA）序列长度足够短的情况下，多价适配体比单价适配体具有更多优势（Hu等人，2022年；Chen等人，2025年）。这些优势主要归因于它们增强的亲和力、更好的稳定性和更快的响应速度以及更强的抗干扰能力。

最近，使用NaBH₄还原贵金属如Au、Ag、Pd、Pt或Ru引起了广泛关注（Safari等人，2016年）。该还原过程高效且环保，没有有害副产物。由于NaBH₄具有高还原效率和低成本，被认为是最合适的还原剂（Shanmugaraj等人，2024年）。DNA模板化的银纳米颗粒（DNA-templated AgNPs）和DNA模板化的银纳米簇（DNA-AgNCs）是通过使用ssDNA作为稳定剂和NaBH₄作为催化剂还原AgNO₃生成的含银纳米材料。它们的显著稳定性和简单的合成过程使其在生物传感中得到广泛应用（Chen等人，2023年）。作为一种新型荧光纳米探针，DNA-AgNCs在富含鸟嘌呤序列的环境中表现出显著的荧光强度增强（Chen等人，2022年）。这种独特的荧光增强现象使DNA-AgNCs作为生物传感领域的荧光探针受到了广泛关注（Li等人，2021年）。DNA模板化的AgNPs作为一种强效纳米材料，在生物传感应用中也发挥着重要作用。它们的优异光学性质和与生物分子的强粘附性使其非常适合构建比色生物传感器（Qu & Ran，2025年）。然而，目前关于将适配体功能化为DNA模板化的银纳米簇（Apt-AgNCs）和DNA模板化的银纳米颗粒（Apt-templated AgNPs）的报道较少（Xu等人，2025年；Lu等人，2024年）。如果将适配体合成成Apt-AgNCs或Apt-templated AgNPs，将使适配体同时具备靶向目标的特异性和纳米材料本身的特性。因此，可以同时扩展适配体和含银纳米材料的应用范围。

由于本文使用的KAN适配体也是托布霉素（TOB）的适配体（Wang等人，2025年），为了确定从该适配体合成的双价适配体（BApt）是否对KAN和TOB具有亲和力和特异性，首先需要进行分子对接研究。随后，利用Apt-AgNCs和Apt-templated AgNPs的特性，合成了基于BApt的BApt-AgNCs和BApt-templated AgNPs，并研究了它们对KAN和TOB的亲和力和特异性，然后使用BApt-AgNCs和BApt-templated AgNPs构建了KAN的比色/荧光双价适配体传感器。本研究旨在探索未来开发广谱氨基糖苷类抗生素快速筛选方法的潜在策略。该方法的比色检测模块利用AgNPs的聚集来实现高效比色信号，通过吸光度值或RGB值分析快速评估样品是否被KAN污染。该方法的荧光检测模块通过BApt-AgNCs构象变化引起的荧光信号变化来精确量化KAN污染水平。两个模块的定量结果不可直接比较或互换，它们构成了一个从现场快速初步筛选到实验室精确验证的完整分析过程。此外，通过测试两种水产养殖水样、虾肉样和牛奶样，详细评估了该KAN适配体的实际应用能力。

化学物质和材料

TOB、KAN、环丙沙星（CIP）、氨苄西林（AMP）、恩诺沙星（ENR）和土霉素（TER）由Macklin Biochemical Technology Co., Ltd（中国上海）提供。4SGelred染料和序列（表S1，由NUPACK软件设计）由Sangon Bioengineering Co., Ltd（中国上海）提供。AgNO₃和NaBH₄由Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd（中国上海）提供。所提到的化学物质和材料符合分析纯度标准。

分子模拟对接

为了确定……

分子对接结果分析

由于TOB和KAN的结构相似，通过将BApt分别与KAN和TOB分子对接，分析和判断了它们结合位点的相似性和差异性，从而为BApt对KAN和TOB的亲和力和特异性提供了理论支持。此外，通过找到结合位点，为后续的BApt截短和优化工作提供了便利。它们的分子对接结果如图S2所示。

如图所示……

结论

总之，选择BApt分别与KAN和TOB进行分子对接。结果表明，BApt与KAN的结合位点多于与TOB的结合位点，证明BApt对KAN的亲和力更强。然而，这仍然是一个推测性的结论。BApt的有效性通过分子对接和实验性能数据得到了验证。未来需要定量表征BApt与KAN的相互作用。

CRediT作者贡献声明

张玉成民：软件、资源、数据管理。王伟霞：验证、方法学。李福厚：可视化、软件、正式分析、数据管理。单磊：方法学、研究、正式分析。陈金瑞：撰写——审稿与编辑、可视化、监督、项目管理、资金获取、概念化。闫欣欣：方法学、研究、数据管理。李星星：可视化、方法学、研究、正式分析。董旭：撰写——

未引用参考文献

Wang等人，2025年。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突。

致谢

本研究得到了中国博士后科学基金会（2023M731397）和江苏海洋大学自然科学基金（KQ23020）的支持。