通过水解辅助的还原胺化反应制备链长可调的工程化乳清蛋白-麦芽糊精缀合物

《Food Hydrocolloids》：Engineering Whey Protein–Maltodextrin Conjugates with Tunable Chain Lengths through Hydrolysis-Assisted Reductive Amination

乳清蛋白经还原胺化与麦芽糊精共价结合，显著提升pH5酸性环境中乳液稳定性，最优组合为麦芽糊精DE4-7与1小时水解乳清蛋白。与美拉德反应相比，该法可控性强、避免高级糖基化产物形成，且能通过空间位阻效应抑制油滴凝聚。研究表明，麦芽糊精链长（DE值）和乳清蛋白水解程度共同影响乳化性能，其中DE4-7与5.6%水解度的组合在储存和热稳定性方面表现最佳。

　　

李洁莹|尤纳斯·达德莫哈马迪|李佩龙|黄宇楠|周玉峰|莱拉·卡兹杜兹|阿明·扎雷伊|阿里雷扎·阿巴斯普拉德

美国康奈尔大学农业与生命科学学院食品科学系，Stocking Hall 243室，伊萨卡，NY 14853

摘要

乳清蛋白被广泛用作乳化剂；然而，在低pH值下，尤其是在接近其等电点（pH 5）时，乳清蛋白会聚集并从油/水界面分离。这会导致乳化产品出现相分离和不稳定。本文报道了通过还原胺化将乳清蛋白与麦芽糊精结合，可以增加空间位阻，从而提高pH 5下的乳化稳定性。与美拉德反应通常只能达到约50%的糖基化程度相比，本研究实现了超过70%的糖基化程度。结合后，在pH 5下储存七天以及高温条件（60°C持续24小时）下，乳化稳定性显著提高。麦芽糊精的链长和乳清蛋白的水解程度对乳化稳定性有影响。使用麦芽糊精（葡萄糖当量（DE）为4-7的结合物表现出更好的乳化性能。在所有结合物中，经过1小时水解（水解程度为5.6%）并与麦芽糊精（DE 4-7）结合的乳清蛋白在应对环境压力方面表现出最高的稳定性，这归因于较高的糖基化程度和适度的蛋白质水解。乳清蛋白-麦芽糊精结合物对乳化液的稳定作用表明，通过还原胺化将蛋白质与多糖结合是一种有前景且高效的方法，可用于增强酸性环境中基于蛋白质的乳化剂的性能。

引言

乳清蛋白是奶酪制造过程中的副产品，主要由β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和牛血清白蛋白组成（de Figueiredo Furtado等人，2022年）。由于其营养价值和功能特性，乳清蛋白在食品科学研究中受到了关注，被认为是一种有效的乳化剂，适用于食品和饮料领域（Silva等人，2020年）。

乳化液由两种不相溶的相组成，需要乳化剂作为稳定剂。乳化剂是两亲分子，能够吸附在液滴表面，防止液滴聚集和相分离（Ravera等人，2021年）。制备乳化液时，分散相在乳化剂的作用下被剪切成液滴。乳清蛋白可以充当乳化剂，但其效果受pH值的影响。具体来说，乳清蛋白在其等电点（pI）附近（约为5）容易聚集，导致乳化液不稳定（Pan等人，2020年）。许多食品产品的pH值都在这个范围内，这给乳清蛋白在食品和饮料中的应用带来了挑战。

提高乳化液稳定性的一个有前景的方法是将蛋白质与多糖结合，通过化学方式将多糖连接到蛋白质乳化剂上。多糖以其pH稳定性著称，由于其体积较大，可以提供空间位阻，有助于防止液滴聚集。美拉德反应是一种非酶促反应，涉及糖的羰基与蛋白质的氨基之间的反应，是一种常用的结合方法。研究表明，这种反应可以通过乳清蛋白-多糖复合物提高油包水（O/W）乳化液的物理稳定性和抗氧化性能（Pan等人，2020年）。然而，美拉德反应的效率较低，动力学不可预测，且对反应路径的控制较差。由于反应会经历早期、中期和后期阶段，很难将其限制在理想的早期结合阶段（Gaber等人，2018年）。在这个阶段，末端氨基酸的α-氨基与还原糖反应形成不稳定的席夫碱，进一步转变为阿马多里产物或海因斯产物。一旦反应超过这个阶段，就会发生褐变、产生异味、蛋白质功能丧失以及形成高级糖基化终产物（AGEs）（Martinez-Alvarenga等人，2014年；Silván等人，2011年）。某些终产物（如丙烯酰胺）具有毒理学问题，这些机制限制了可实现的糖基化程度（DG）。

然而，还原胺化是一种更可控、更高效的蛋白质与多糖结合方法。该方法涉及多糖的羰基与蛋白质的氨基形成亚胺离子，然后进一步还原形成稳定的共价键（Zhou等人，2021年）。这种反应绕过了多步骤的美拉德途径，避免了AGEs的形成，并实现了更可控、更高效的结合，糖基化程度也更高且更可预测。据我们所知，还原胺化尚未被用于将乳清蛋白与多糖结合以增强乳化性能。因此，在本研究中，我们探讨了还原胺化结合乳清蛋白与麦芽糊精以改善酸性pH下油包水（O/W）乳化液稳定性的潜力。

蛋白质水解会暴露氨基，增加可用于还原胺化的反应位点数量。此外，乳清蛋白水解物具有生物活性，据报道可以改善乳化系统的氧化稳定性，提供额外的功能优势（Taghvaei等人，2014年）。

我们假设将乳清蛋白与麦芽糊精结合可以延长基于乳清蛋白的乳化液在酸性pH下的稳定性，并由于麦芽糊精链提供的空间位阻而提高长期储存和温度稳定性。研究了乳清蛋白与麦芽糊精之间的结合程度、麦芽糊精链的长度以及乳清蛋白的水解程度对乳化稳定性的影响。通过研究这些因素，阐明了乳清蛋白-麦芽糊精稳定乳化液的稳定机制。本文展示了适用于各种食品应用的稳定且高效的基于乳清蛋白的乳化剂的开发过程。

材料

乳清蛋白分离物（Provon 190，纯度90%）由Glanbia Nationals（美国威斯康星州菲奇堡）提供；Biozate 9是一种水解度为10%的乳清蛋白水解物，由Agropur（美国威斯康星州阿普尔顿）提供。麦芽糊精的葡萄糖当量（DE）分别为13.0-17.0和4.0-7.0，L-亮氨酸（试剂级，>98%），邻苯二甲醛（OPA，>97%），十二烷基硫酸钠（>98.5%），β-巯基乙醇（分子生物学级），以及2,2'-偶氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）

水解程度

根据OPA方法，测定了不同水解时间下乳清蛋白分离物（WPI）的水解程度（图2A）。经过0.5小时的水解后（WPH_0.5h），水解程度达到3.9%。将水解时间延长至1小时后（WPH_1h），水解程度显著增加至5.6%（p < 0.05）。进一步延长至4小时后（WPH_4h），水解程度达到9.2%。这一趋势符合预期，即更长的水解时间使酶能够切割更多的肽键。

结论

总之，制备了七种乳清蛋白-麦芽糊精结合物，与单独使用乳清蛋白分离物相比，在pH值、储存稳定性和温度稳定性方面都有显著改善。研究了麦芽糊精链长度和乳清蛋白水解程度对乳化稳定性的影响。含有较长链的麦芽糊精结合物稳定的乳化液在储存和温度下的稳定性优于含有较短链的麦芽糊精结合物。

CRediT作者贡献声明

阿里雷扎·阿巴斯普拉德：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源管理，项目管理，资金获取，概念构思。李洁莹：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，方法学研究，数据分析，概念构思。尤纳斯·达德莫哈马迪：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念构思。李佩龙：撰写 – 审稿与编辑，方法学研究，数据分析。黄宇楠：撰写 – 审稿与

未引用参考文献

Lin等人，2022年。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

CLSM成像数据通过康奈尔大学生物技术资源中心（RRID:SCR_021741）获取，NIH资助（S10RR025502）。特别感谢Kelley J. Donaghy博士对手稿的编辑工作。