《Franklin Open》：Growth arrest-specific 6 rejuvenates senescent HUCMSCs through upregulating Nrf2 for diabetic wound therapy
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糖尿病足溃疡难治，间充质干细胞（MSCs）条件培养基（CM）疗法因细胞移植风险而受限。本研究发现GAS6通过激活PI3K/Akt通路增强p62表达，促进Keap1降解，使Nrf2核转，抑制氧化应激并延缓MSCs衰老，同时增强其CM的血管生成能力。
赵晓芳|刘成云|宋蓓|范浩辉|刘婷|广学科|高光宇|张新月|周全|胡静琼|王坤|卢伟林
华中科技大学同济医学院联合医院老年病科，武汉，中国
摘要
糖尿病足溃疡作为糖尿病最严重的并发症之一，对传统治疗方法的反应通常有限。间充质干细胞（MSCs）为糖尿病伤口愈合提供了一种有前景的再生策略。然而，体外扩增的MSCs容易发生增殖老化，这限制了其临床应用。生长停滞特异性基因6（GAS6）在多种细胞和组织修复过程中发挥着多种作用。本研究探讨了GAS6对MSCs衰老及其相关细胞内信号通路的影响，并评估了其增强衰老MSCs在糖尿病伤口愈合中的再生能力。GAS6显著改善了MSCs的衰老表型，而siGAS6则导致了MSCs的衰老。GAS6通过p62依赖的自噬途径调节Keap1的降解，从而促进Nrf2进入细胞核发挥抗衰老作用。同时，研究证实GAS6通过激活PI3K/Akt通路调节Keap1和Nrf2，从而延缓MSCs的衰老。GAS6通过上调Nrf2增强了衰老MSCs来源的条件培养基（MSCs-CM）的血管生成能力，这一效应在细胞和动物水平上都得到了验证。GAS6还通过激活PI3K/Akt信号通路促进了p62的积累，p62与Keap1结合后促进了Keap1的降解，并竞争性地抑制了Keap1与Nrf2的结合，减少了Nrf2的泛素化和降解。最终，Nrf2在细胞内积累并转移到细胞核，与抗氧化基因结合，延缓了MSCs的衰老。此外，GAS6还通过上调Nrf2增强了衰老MSCs-CM的血管生成能力。
引言
全球人口老龄化趋势导致糖尿病患病率急剧上升，糖尿病现已被公认为一个重大的公共卫生危机[1]。这种代谢紊乱不仅表现为血糖控制失调，还会引发一系列病理反应，严重影响患者健康。其中，糖尿病足溃疡是一种特别顽固的并发症，其发病率高且治疗难度大，给患者带来多重负担[2]。现有的管理策略临床效果有限。虽然姑息性措施可以暂时缓解症状，但未能从根本上解决潜在的病理生理机制，导致愈合时间延长和复发率居高不下[3]。外科干预虽然能够重建血管和清除坏死组织，但对许多伴有其他疾病的虚弱患者存在较大风险[4]。这种治疗困境凸显了开发创新疗法以修复受损伤口的迫切需求。
间充质干细胞（MSCs）为糖尿病足溃疡的治疗提供了有希望的策略。与MSCs本身相比，MSCs来源的条件培养基（MSCs-CM）具有明显优势，如消除了细胞移植的风险、无致癌潜力，并提高了储存和运输的可行性[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。值得注意的是，MSCs-CM在促进糖尿病伤口愈合方面比MSCs本身更有效[10]。其治疗机制涉及多种途径，包括减轻氧化应激损伤、促进血管生成、增强细胞增殖和迁移、促进胶原蛋白沉积以及调节炎症微环境[11]、[12]、[13]。然而，研究表明衰老的MSCs的促血管生成能力显著下降[14]、[15]、[16]。细胞衰老会损害MSCs-CM的组成和功能，从而限制其临床应用[17]、[18]、[19]。因此，当前的研究重点集中在两个方面：开发延缓MSCs衰老的干预措施，或优化来自衰老MSCs的培养基的治疗潜力。
氧化应激是MSCs衰老的关键机制之一[18]、[20]。该过程会产生过多的活性氧（ROS），对DNA、蛋白质和脂质等关键细胞内大分子造成损伤[21]。这些损伤的累积会激活与衰老相关的信号通路，最终使细胞进入衰老状态。研究表明，在MSCs衰老过程中，ROS水平显著升高，而抗氧化防御系统功能受损，导致细胞内氧化还原平衡失调[18]。这些变化表现为增殖能力下降、形态改变和分泌功能异常。Nrf2作为细胞抗氧化防御系统的主调控因子，通过调控抗氧化基因的表达来维持氧化还原平衡，在MSCs衰老中发挥关键作用[22]。在生理条件下，Nrf2与Keap1结合并经历泛素化介导的降解。然而，氧化应激会促使Nrf2与Keap1分离，使其能够进入细胞核并与抗氧化响应元件结合，激活HO-1、NQO1和SOD等细胞保护基因的表达[23]。这些基因的表达上调增强了细胞的抗氧化能力，有效清除多余ROS，延缓了MSCs的衰老。值得注意的是，衰老的MSCs中Nrf2的表达和活性逐渐下降，导致抗氧化防御能力减弱[22]。这种机制理解表明，以Nrf2为中心的干预策略是缓解MSCs衰老的有前景的治疗靶点。
生长停滞特异性基因6（GAS6）在组织修复和发育过程中的生长和存活过程中发挥关键作用[24]、[25]、[26]、[27]、[28]。关于维生素K的研究表明，GAS6可以保护神经元并延缓神经细胞的衰老[27]。已有研究证实GAS6可以延缓血管平滑肌的衰老[25]。研究还证明GAS6可以保护细胞免受氧化应激的损害[29]、[30]、[31]。可以推测GAS6可能通过降低细胞的氧化应激水平来延缓衰老。一项研究还发现，GAS6上调Nrf2的表达可以保护心肌细胞免受氧化应激引起的损伤[29]。我们之前的研究表明，将GAS6工程化的骨髓MSCs注射到心肌中可以显著提高骨髓MSCs的移植存活率并改善心脏功能[32]。因此，我们想知道GAS6是否也能延缓MSCs的衰老。这一过程是否涉及Nrf2尚不清楚。GAS6增强衰老MSCs在糖尿病伤口中的治疗效果潜力值得进一步探索。尽管GAS6的作用已被认可，但其在人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）中的确切分子通路——特别是其与p62-Keap1-Nrf2轴的关联——尚未明确。GAS6信号通路在对抗干细胞衰老和维持HUCMSCs血管生成功能中的功能意义尚不清楚。目前尚未建立连接GAS6、选择性自噬（p62）和核心抗氧化机制（Keap1-Nrf2）的完整调控网络。
本研究探讨了GAS6对过氧化氢（H?O?）诱导的人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）衰老的影响。我们还研究了rhGas6预处理后的HUCMSCs在体内和体外调节血管生成中的旁分泌作用。最后，深入研究了上述过程中Nrf2信号通路的分子机制。我们的结果阐明了GAS6对氧化应激诱导的衰老的影响及其在HUCMSCs中的作用机制。
细胞培养
HUCMSCs由武汉Hamilton生物技术有限公司提供。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）由华中科技大学同济医学院联合医院心血管疾病实验室捐赠。实验中使用了第4或第5代的HUCMSCs和HUVECs。
HUCMSCs衰老的诱导与检测
通过使用H?O?诱导HUCMSCs的衰老，当细胞达到70%汇合度时施加H?O?
衰老HUCMSCs的血管生成能力显著受损
本研究利用H?O?建立了HUCMSCs的衰老模型。初步实验评估了不同浓度H?O?对HUCMSCs存活率的影响。CCK8检测结果显示，细胞存活率随H?O?浓度的增加而下降，IC??值为167.63μM（图1A）。基于这些结果，初步选择了165μM的H?O?浓度用于后续的衰老诱导实验。
讨论
本研究阐明了GAS6在对抗衰老和增强HUCMSCs功能能力方面的双重作用。衰老MSCs中GAS6的表达水平降低。GAS6通过激活PI3K/Akt信号通路促进了p62的积累。p62与Keap1结合后促进了Keap1的降解，并竞争性地抑制了Keap1与Nrf2的结合，减少了Nrf2的泛素化和降解。最终，Nrf2在细胞内积累并转移到细胞核
结论
总之，我们的研究发现了一个分子级联反应：GAS6介导的PI3K/Akt上调促进了p62的积累，进而诱导了Keap1的自噬降解。这种降解使Nrf2从Keap1的调控中释放出来，使其能够进入细胞核并减轻HUCMSCs的衰老。此外，我们还发现了GAS6通过激活Nrf2/HO-1轴来增强衰老HUCMSCs的血管生成潜力。
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张新月：资源、方法学、实验设计。
高光宇：可视化、方法学、数据管理。
广学科：初稿撰写、软件使用、资源准备、方法学。
刘婷：验证、软件使用、方法学、数据管理。
范浩辉：初稿撰写、验证、软件使用、方法学。
宋蓓：初稿撰写、资源准备、方法学、数据管理。
刘成云：审稿与编辑、初稿撰写、项目协调、资金申请。
伦理批准与参与同意
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出版同意
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数据和材料的获取
本研究的数据可向相应作者索取。
利益冲突
作者声明本研究不存在任何可能构成利益冲突的商业或财务关系。
资助
本研究得到了
国家自然科学基金（编号81974222）和湖北省重点研发计划（编号2023BCB145）的支持。
利益冲突声明
作者声明本研究不存在任何可能构成利益冲突的商业或财务关系。
致谢
我们衷心感谢同济医学院联合医院心血管疾病实验室和武汉Hamilton生物技术有限公司慷慨提供实验所需的HUVECs和HUCMSCs。他们的贡献对实验的顺利进行至关重要。
