大肠杆菌应激适应的表观转录组调控机制：酸和氧化应激下RNA修饰的动态图谱与功能解析

《Nucleic Acids Research》：Epitranscriptomic control of stress adaptations in Escherichia coli

本研究通过纳米孔直接RNA测序等技术，系统揭示了大肠杆菌在酸应激和氧化应激早期应答中mRNA、rRNA和tRNA的RNA修饰动态变化。研究发现应激特异性修饰模式，特别是rRNA解码中心的m4Cm1402和m5C1407修饰水平升高，以及tRNA摆动区Q和Mnm通路修饰的应激依赖性积累。通过突变体表型分析证实这些修饰对细菌运动性和应激生存力具有关键调控作用，首次构建了细菌早期应激应答的多维表观转录组调控网络。

当细菌遭遇环境剧变时，它们如何在分子层面快速启动防御机制？传统认知聚焦于转录组和蛋白质组的重编程，但RNA化学修饰这一"暗物质"层面是否参与应激调控仍是未解之谜。尤其在大肠杆菌这类模式生物中，酸应激（如经胃部环境）和氧化应激（如膀胱中活性氧攻击）是常见挑战，但对应激早期（15分钟内）发生的表观转录组事件仍缺乏系统认知。

为解析这一科学盲区，研究团队设计了精细的应激实验体系：通过过氧化氢诱导氧化应激（2/4mM）、盐酸调节pH模拟酸应激（pH5.8→4.4），在应激暴露15分钟时捕捉早期应答。采用多维技术联用策略：纳米孔直接RNA测序（DRS）实现单分子水平修饰检测，质谱（MS）进行绝对定量验证，同时结合单核苷酸PCR和突变体表型分析。特别创新地使用两种样本制备方法——mRNA富集样本（含未成熟pre-tRNA）和Nano-tRNAseq样本（富集成熟tRNA），从而区分不同成熟度RNA分子的修饰动态。

关键技术方法包括：（1）纳米孔测序数据用Dorado碱基识别和Minimap2比对；（2）通过basecalling error（BCError）算法和nanoSundial软件识别修饰位点；（3）同位素稀释质谱绝对定量22种修饰；（4）体外转录RNA作为无修饰对照；（5）临床分离株和标准菌株MG1655的比对分析。

研究结果揭示多层次调控机制：

一、rRNA修饰重编程应激适应性

通过对比应激/无应激样本的BCError值变化（ΔBCError），发现16S rRNA的m⁴Cm1402和m⁵C1407修饰在两种应激下均显著增加。这些位点位于核糖体解码中心，突变实验证实其功能性：ΔrsmH（m⁴C1402缺陷）在氧化应激下延迟期延长，ΔrsmF（m⁵C1407缺陷）生长速率下降，ΔrsmH在酸应激中存活率降低。表明这些修饰通过稳定密码子-反密码子配对提高翻译保真度。

二、tRNA修饰展现应激特异性调控

应激响应存在明显分化：氧化应激导致16种pre-tRNA anticodon环修饰减少，伴随未成熟转录本累积；酸应激则使9种tRNA摆动位点（Q/Mnm通路修饰）修饰增加，且这些tRNA成熟度更高。功能富集显示，高修饰依赖性密码子富集于应激响应基因（如外排泵基因emrB、膜应激蛋白mlaB），而看家基因偏好修饰非依赖性密码子。突变体ΔmnmE和Δtgt均出现运动缺陷，验证修饰对运动相关基因翻译的调控。

三、mRNA修饰具有功能区位特异性

在400个高修饰依赖性密码子转录本中，检测到CDS区修饰富集，特别是代谢和转运相关基因。虽然整体修饰位点数量较少，但应激响应基因的修饰分布提示其可能通过影响mRNA稳定性间接调控基因表达。

结论表明，细菌采用"双轨制"表观转录组策略应对不同应激：氧化应激通过抑制tRNA成熟保存资源，酸应激则增强特定tRNA修饰以优先翻译应激防御蛋白。该研究首次绘制细菌应激应答的RNA修饰图谱，揭示rRNA解码中心修饰是应激适应的关键检查点，为针对细菌应激通路的抗菌策略提供新靶点。论文发表于《Nucleic Acids Research》，为原核生物表观转录组学研究树立新范式。