一种用于检测产毒蓝藻的qPCR分析现场方法的评估

《Harmful Algae》：Evaluation of a Field Method for qPCR analysis of Toxigenic Cyanobacteria

便携式qPCR方法现场检测微囊藻毒素及有害蓝藻 blooms，与实验室方法结果一致，适用于水源和娱乐水即时检测。

伊恩·斯特鲁温（Ian Struewing）|艾梅·亨德森（Aimèe Henderson）|内森·西恩凯维奇（Nathan Sienkiewicz）|威廉·霍布斯（William Hobbs）|斯泰西·科克伦（Stacey Cochran）|卢静rang（Jingrang Lu）

美国环境保护署，研究与发展办公室，辛辛那提，俄亥俄州 45268，美国

摘要

定量聚合酶链反应（qPCR）是一种成熟的用于微生物分子检测和定量的方法。利用qPCR检测产毒蓝藻也被证明是预测蓝藻毒素产生和有害蓝藻水华（cHABs）形成的有效工具。最近，已经开发出便携式热循环仪以及提取程序和试剂，以便在现场进行qPCR分析。然而，尚未评估便携式qPCR分析在检测和定量产毒蓝藻方面的应用效果。本文评估了一种使用Biomeme Franklin热循环仪进行DNA提取和qPCR分析的现场方法，用于检测产毒蓝藻。该便携设备获得的结果能够识别并定量产毒的微囊藻（Microcystis），其结果与实验室提取和分析的结果相当。这种现场提取和qPCR分析方法为评估水源水和娱乐用水中的有毒蓝藻提供了新的研究工具，使用户能够立即在现场获得产毒微囊藻的识别和定量结果。

章节摘录

背景与目的

蓝藻有害水华（cHABs）及其产生的毒素对水生生态系统的安全性和人类健康构成严重威胁（Lin 1972; Rabalis et al., 2010; Paerl 2018; Lu et al., 2019; Lu et al., 2020; Amorim & Moura 2021）。这些毒素对人体具有急性的肝脏和神经系统毒性作用（例如，微囊藻毒素和鱼腥藻毒素），当水华形成且蓝藻毒素达到一定浓度时，会导致饮用水和娱乐用水的污染警告。

蓝藻培养

蓝藻菌株微囊藻蓝菌（Microcystis aeruginosa）、花水绵（Anabaena flos-aqua）、圆柱形鱼腥藻（Anabaena Cylindrica）、鱼腥藻属（Anabaena）1448、颤藻属（Ocillatoria）、河口颤藻（Lyngbya aestuarii）、Aphanazomenon flos-aqua、Plantothrix aghardii和Dolichospermum circianale在BG-11培养基（Phytotech Labs, Lenexa, KS）中培养，培养条件为1×浓度，温度20°C，环境舱内光照/黑暗周期为14/10小时，光照强度为44.02 μmol/m²/s¹，使用LICOR LI-1500荧光仪测量。

引物特异性和标准曲线分析

通过使用从实验室培养的各种蓝藻菌株中提取的基因组DNA来验证mcyEmic检测方法的引物和探针特异性。微囊藻蓝菌（Microcystis aeruginosa被用作阳性对照，非目标菌株包括花水绵（Anabaena flos-aqua）的非产毒菌株、圆柱形鱼腥藻（Anabaena Cylindrica）、鱼腥藻属（Anabaena）1448、颤藻属（Ocillatoria）、河口颤藻（Lyngbya aestuarii、以及一种产生圆柱孢菌素的Aphanazomenon flos-aqua菌株。

讨论

我们的目标是开发并评估一种便携式方法，利用qPCR在现场进行产毒微囊藻的识别、检测和定量，包括现场提取和分析。我们使用便携式Franklin热循环仪开发并评估了总蓝藻（16Scyano）和产微囊藻毒素的微囊藻物种（mcyEmic）的检测方法，并将现场方法的性能与传统的实验室方法进行了比较（Duan et al. 2022; Lu et al., 2020）。

结论

本文评估了一种便携式的现场方法，用于使用qPCR从水样中提取、识别和定量蓝藻。首先，我们确认在便携式Franklin热循环仪上制备的复合标准品与传统的实验室方法所得结果具有可比性。在不同基质中，比较了两种提取方法对添加的微囊藻细胞的回收率。总体而言，现场方法和实验室方法的回收率相当。

作者贡献

IS：概念构思、方法论、初稿撰写、数据分析。AH：方法论、实验研究、审稿和编辑。NS：概念构思、实验研究、审稿和编辑。WH：实验研究、审稿和编辑。SC：实验研究、审稿和编辑。JL：概念构思、项目监督。

未引用的参考文献

(Meichtry de Zaburlín et al., 2016, nwtoxicalgae.org 2024年12月3日, Francy et al., 无日期)

CRediT作者贡献声明

伊恩·斯特鲁温（Ian Struewing）：初稿撰写、方法论设计、数据分析、概念构思。艾梅·亨德森（Aimèe Henderson）：审稿与编辑、方法论研究、实验研究。内森·西恩凯维奇（Nathan Sienkiewicz）：审稿与编辑、实验研究、概念构思。威廉·霍布斯（William Hobbs）：审稿与编辑、实验研究。斯泰西·科克伦（Stacey Cochran）：审稿与编辑、实验研究。卢静rang（Jingrang Lu）：...