pH值调节结合微流控处理改性菜籽蛋白分离物：分子结构与功能特性

《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：pH-shifting combined with microfluidization treatment modified rapeseed protein isolates: Molecular structure and functional characteristics

菜籽蛋白 isolate（RPI）通过pH调整（9-12）联合微流化处理（60MPa，5次循环）显著改善溶解性及消化率。光谱与分子动力学模拟表明，处理使紧密结构的RPI分子解折叠，β-折叠和随机卷曲转化为α-螺旋，巯基含量增加，颗粒尺寸减小至114.68nm，溶解度提升70.33%，氨基酸溶出量达5mM。该联合方法为提升植物蛋白功能特性提供了新途径。

　　

谢一莎|舒文静|陈颖|刘青茹|刘青青|袁永军

四川省食品微生物学重点实验室，四川与重庆共建的特种食品重点实验室，西南大学食品与生物工程学院，中国成都610039

摘要

菜籽蛋白分离物（RPI）具有紧密的结构，这限制了其在食品工业中的应用。本研究通过改变pH值（9、10、11和12）并结合微流控处理来修饰RPI的分子结构，以改善其功能特性，未改变pH值的样品（RPI-7）作为对照。光谱和分子动力学模拟结果表明，经过联合处理后，RPI的紧密结构得以展开。颗粒尺寸的减小、二级结构从β-折叠和无规卷曲转变为α-螺旋，以及巯基（SH）含量的增加，有助于提高RPI的溶解度和消化率。RPI-12在消化液中的溶解度和氨基酸含量分别增加了70.33%和5 mM。因此，改变pH值并结合微流控处理是一种有效的方法，可以增强菜籽蛋白的功能特性，对于改善植物基蛋白的技术功能特性具有潜力。

引言

根据联合国五个专门机构联合发布的2023年《世界粮食安全与营养状况》（SOFI）报告，全球约有7.33亿人受到饥饿的影响（WHO，2024年）。为了应对这一挑战，人们提出了不同的策略，包括探索新的蛋白质来源，如植物基蛋白质（Ramírez-Guzmán等人，2023年）。菜籽（Brassica napus L.），包括油菜品种，是一种全球广泛种植的主要油料作物，其产量仅次于大豆（Karabulut等人，2025年）。从菜籽油提取的主要副产品是菜籽粕，其中含有丰富的蛋白质（30–50%）（Zhang, Fang等人，2024年）。这种较高的蛋白质含量使得菜籽粕成为一种有前景的植物源蛋白质，具有巨大的经济潜力，可用于食品系统。尽管菜籽中含有抑制营养吸收的抗营养因子，如硫代葡萄糖苷和植酸，但其蛋白质是必需含硫氨基酸的宝贵来源，其中蛋氨酸和半胱氨酸的含量与牛奶酪蛋白、鸡蛋、大豆和动物蛋白相当（Karabulut等人，2025年）。据报道，菜籽蛋白分离物（RPI）的可消化必需氨基酸评分（DIAAS）与大豆蛋白分离物相当（97%），并且经过热处理后RPI的DIAAS超过100，属于优质蛋白质来源（Karabulut等人，2025年）。此外，热处理后的菜籽蛋白分离物未观察到限制性氨基酸（Bailey等人，2023年）。然而，与许多植物基蛋白质类似，菜籽蛋白具有高度有序的结构，这影响了其功能特性。特别是其较差的溶解度严重阻碍了其在食品系统中的大规模应用（Chen等人，2024年）。在超声波辅助的pH值改变条件下（20 kHz，pH 12.5），RPI的溶解度提高到了66.84%（Li等人，2020年）。糖基化和琥珀酰化也被用于提高菜籽蛋白的溶解度，达到了65.85 ± 8.45%（Chen等人，2025年）。Zhang等人（2022年）应用动态高压微流控技术改变了RPI的结构和流变特性，但未提及与溶解度相关的结果。在我们之前的（未发表）研究中，高压微流控处理（高达600 MPa，5次循环）将RPI的溶解度提高了50.63%。然而，这一数值仍低于食品工业应用通常要求的标准。因此，选择合适的改性技术以增强菜籽蛋白的功能特性是目前的主要研究方向。

一般来说，天然食品蛋白质通过多种化学力（如疏水作用、氢键和范德华力）紧密相连。这些相互作用的平衡显著影响食品蛋白质的溶解度。当蛋白质-蛋白质相互作用超过蛋白质-水相互作用时，蛋白质在水溶液中的溶解度会降低（Tang等人，2021年）。为了提高蛋白质的溶解度，人们建立了许多方法，包括物理技术（如微流控）和化学方法（如pH值改变处理），以及两者的组合。其中，pH值改变过程作为一种相对简单的技术，通过强烈的静电排斥作用破坏蛋白质相互作用（Jeong & Cho，2024年），从而显著改善食品蛋白质的功能特性，如溶解度。该技术已成功应用于改良多种蛋白质，包括添加鹰嘴豆蛋白的强化牛奶（Liao等人，2024年）、绿豆蛋白分离物（Jeong & Cho，2024年）和葵花籽蛋白分离物（???imen & Aslan Türker，2025年）。动态高压微流控（DHPM）为增强植物基蛋白质的功能性提供了有前景的方法，已被用于改善花生蛋白分离物的凝胶化特性（Li, Chen等人，2025年），以及提高紫苏籽蛋白（Sahil等人，2025年）和不溶性豌豆蛋白（Moll等人，2021年）的溶解度。DHPM处理过程中产生的强烈机械力减小了蛋白质颗粒尺寸，从而削弱了蛋白质-蛋白质相互作用，同时促进了蛋白质-水相互作用，最终提高了溶解度（Sahil等人，2025年）。值得注意的是，在DHPM处理中，施加的压力与蛋白质溶解度之间没有表现出正线性关系。花生蛋白分离物在低于120 MPa的压力下发生解聚，而超过这一阈值后则重新聚集（Gong等人，2019年）。

为了有效改性植物源蛋白质，人们采用了多种物理化学改性方法，如pH值改变和超声波处理（Jiang等人，2017年）、碱处理和热处理（Limpisophon等人，2024年），以增强植物基蛋白质的溶解度并扩大其在食品系统中的应用。Zhao等人（2025年）证明，同步进行pH值改变和超声波处理比单独使用任何一种方法更能有效提高核桃蛋白的溶解度、持水能力和起泡/乳化能力。此外，碱处理对蛋白质的功能特性也有积极影响。Tang等人（2023年）发现，pH 10下热处理的燕麦蛋白具有最高的持水能力，而pH 2或未经热处理的蛋白质则不然。类似的结果也出现在藜麦蛋白分离物上，即在碱性（pH 8–12）条件下进行pH值改变后进行高压均质化处理的样品，其可溶性蛋白质含量高于在酸性（pH 2–6）条件下进行高压均质化处理的样品（Yildiz & Y?ld?z，2023年）。然而，据我们所知，目前还没有系统研究pH值改变与微流控结合对菜籽蛋白分离物的影响。

人们普遍认为，植物蛋白质在碱性pH下可溶解，这有利于进一步的改性加工。本研究探讨了通过pH值改变处理（9、10、11和12）结合微流控处理（60 MPa，5次循环）提高菜籽蛋白分离物（RPI）溶解度的机制，未改变pH值的样品RPI-7作为对照。通过紫外吸收光谱、内在荧光和傅里叶变换红外（FTIR）光谱表征了RPI的结构变化。此外，通过测量溶解度和颗粒尺寸、进行分子动力学（MD）模拟以及确定体外消化率，系统评估了联合处理对蛋白质聚集和消化率的影响。本研究旨在为菜籽蛋白分离物溶解度的增强机制提供有价值的贡献，并有助于RPI在食品加工中的应用。

材料

菜籽蛋白购自西安兰利生物科技有限公司，其蛋白质含量根据凯氏定氮法为39 ± 5.1%（F = 5.53）。牛血清白蛋白（BSA，纯度>99.0%）购自上海REGAL生物科技有限公司（中国上海）。SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、蛋白质分子量标记物（10–150 kDa，未染色）和2 × SDS-PAGE蛋白质加载缓冲液购自Beyotime Biotech公司（中国）。胰蛋白酶（1:250）和三氯乙酸

RPI的溶解度和浊度变化

溶解度是蛋白质的基本功能特性之一，因为它对其他特性（如凝胶化）有重要影响（Tan等人，2021年）。如表1所示，未调整pH值的样品（即RPI-7）在水中的溶解度最低（24.63%），同时浊度最高（2.25）。这与样品溶液的外观状态一致（图1），蛋白质溶液不透明，难以看清样品瓶后的物体。

结论

本研究系统研究了pH值改变（7、9、10、11和12）结合微流控处理对菜籽蛋白分离物的物理化学性质、技术功能性能和微观结构特征的影响。极端的pH值改变处理可以使蛋白质结构变得更加灵活并部分展开，结合微流控的机械效应，RPI-12的颗粒尺寸显著减小至114.68 nm。

CRediT作者贡献声明

谢一莎：撰写 – 原始草稿，资金获取，监督。舒文静：撰写 – 原始草稿，方法学，正式分析，数据管理。陈颖：研究。刘青茹：撰写 – 审稿与编辑。刘青青：撰写 – 审稿与编辑，监督。袁永军：资源获取，资金获取，正式分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了四川省科技计划 [项目编号 2024NSFSC1253]、国家自然科学基金 [项目编号 32502266]和“天府菜籽油”加工关键技术 [项目编号 2023TFRO05]的支持。