《International Journal of Antimicrobial Agents》：Rapid Detection of NDM-Producing Carbapenem-Resistant
Escherichia coli Using MALDI-TOF MS Combined with Machine Learning Techniques
编辑推荐：
本研究采用MALDI-TOF MS结合随机森林算法，利用合作矩阵（CHCA-C3和CHCA）快速检测产NDM的CREC大肠杆菌，成功鉴定m/z 5132、5209等特征峰，并通过分子验证确认其与NDM基因表达相关，显著提升临床耐药检测效率。
董荣荣|王一飞|宋磊|王佳音|杨春|纪旭峰|周琦|王浩|郭新华|徐建成
吉林大学第一医院实验室医学系，长春130021，中国
摘要
背景
产生新德里金属β-内酰胺酶（NDM）的碳青霉烯类耐药大肠杆菌（CREC）对全球公共卫生构成了严重威胁。及时检测CREC对于有效管理患者和控制耐药性的传播至关重要。
目的
本研究旨在利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）结合机器学习（ML）技术，建立一种快速可靠的NDM产生CREC检测方法。
方法
2018年8月至2022年12月期间，从吉林大学第一医院的临床实验室收集了大肠杆菌临床分离株。通过PCR检测分离株中的23种常见耐药基因。使用(E)-丙基α-氰基-4-羟基肉桂酸酯（CHCA-C3）和α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）作为协作基质，通过MALDI-TOF MS分析蛋白质谱。通过比较九种ML算法，确定了最佳的随机森林（RF）算法，并用其找到NDM特异性离子峰。此外，将NDM基因克隆到标准大肠杆菌菌株ATCC 25922中，以验证这些特异性峰的可靠性。
结果
共154株大肠杆菌被分为三组：45株CREC菌株、58株产广谱β-内酰胺酶（ESBL）菌株和51株非CREC、非ESBL菌株。PCR扩增检测出12种耐药基因。建立的基于RF算法的ML模型表现出优异的区分能力，AUC为0.993，AP为0.997。使用协作基质，检测到了NDM的四个特异性峰（m/z 5132、m/z 5209、m/z 6350和m/z 6371）。相比之下，传统的CHCA基质未显示特异性峰。此外，在重组大肠杆菌菌株ATCC 25922-PZY01/NDM的MALDI-TOF MS谱中检测到了m/z 5132和m/z 5209的特异性峰，这些峰与NDM基因的表达直接相关。
结论
通过协作基质方法将MALDI-TOF MS与ML技术相结合，实现了NDM产生CREC的快速准确识别。这一进展显著提高了临床管理的效率和控制医院获得性感染的效果。
引言
抗生素耐药性对全球公共卫生构成了重大挑战。多重耐药、广泛耐药和全耐药细菌的出现和传播对人类健康构成了严重威胁。[1] 以广泛多重耐药性著称的碳青霉烯类耐药肠杆菌科（CRE）已成为公共卫生的重大威胁。[2] CRE的主要耐药机制是碳青霉烯酶的产生，这是最关键的因素。[3] 具体而言，超过70%的碳青霉烯类耐药大肠杆菌（CREC）菌株会产生新德里金属β-内酰胺酶（NDM），这与高患者死亡率（9%至40%）密切相关。[4] 因此，开发快速准确的检测方法对于指导临床合理使用抗生素和控制医院内耐药细菌的传播至关重要。[5]
聚合酶链反应（PCR）是一种广泛用于检测耐药基因类型的方法。尽管PCR具有高特异性和敏感性，但其过程可能较为繁琐，且每次检测的试剂成本较高，这在一定程度上限制了其在临床微生物学实验室中的常规应用。[6] 酶免疫测定技术虽然快速准确，但仅限于检测特定类型的酶，并且试剂成本较高，从而限制了其更广泛的应用。最近，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）因其简单性、高通量、准确性和成本效益而受到青睐，用于临床病原体的鉴定。[7] 最近的研究表明，特定细菌亚型在其MALDI-TOF MS谱中表现出特定的质量峰。研究表明，MALDI-TOF MS谱中的特定质量峰与特定的细菌亚型和耐药机制相关。[8,9] 例如，Nakamura等人报告了B2-ST131大肠杆菌中的m/z 7650特异性峰，[10] 而Zhang等人在ST45耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中检测到了m/z 4808和9614的特异性峰。[11] 此外，Kwon等人识别出了m/z 10,152和5,070的特异性峰，准确指出了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的spa复合体VI亚组。[12]
尽管近年来MALDI-TOF MS已通过经典统计方法鉴定的特定生物标志物来检测细菌的抗生素耐药性，但MS谱中仍包含大量未解析的信息。机器学习（ML）作为人工智能的一个子集，在疾病诊断（包括癌症和传染病）相关的研究领域引起了广泛关注。[13] ML利用自监督学习深入分析数据中的非线性相关性，消除无关变量，并转换MS数据表达，从而最大限度地利用MS谱中的模糊信息。研究表明，ML可以通过分析不同细菌菌株之间的MS数据变化来快速评估耐药性。[14] 例如，Wang等人开发了随机森林（RF）、支持向量机（SVM）和降维SVM（SVM-K）模型来区分碳青霉烯类耐药和碳青霉烯类敏感的肺炎克雷伯菌（CRKP和CSKP）。[15] Mather等人使用SVM算法识别细菌的特异性峰，并构建了一个模型，成功区分了万古霉素中介型和万古霉素敏感型金黄色葡萄球菌。[16] 这些研究突显了将ML技术与MALDI-TOF MS结合用于检测细菌抗生素耐药性的巨大潜力。
在MALDI-TOF MS分析中，基质对目标分子的离子化至关重要。[17] α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）是MALDI-TOF MS细菌分析中常用的蛋白质/肽基质。[18] Wang等人引入了一种新型酯化CHCA基质（(E)-丙基α-氰基-4-羟基肉桂酸酯（CHCA-C3），其在分析疏水性蛋白质方面表现出更好的性能。[19] 另一项研究表明，当使用CHCA-C3作为基质时，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌产生的特异性峰位于m/z 2306和2322，而使用传统CHCA基质时则没有这些峰。[20] 基于这些发现，本研究将MALDI-TOF MS与ML结合，利用协作基质来识别产生NDM的碳青霉烯类耐药大肠杆菌。此外，还整合了分子生物学技术来阐明这些峰的起源，为在细菌耐药性检测中应用MALDI-TOF MS提供了理论支持。这种方法对于控制医院获得性感染和遏制NDM产生大肠杆菌的全球传播至关重要。
章节片段
临床菌株收集和抗菌药物敏感性测试
2018年8月至2022年12月期间，从吉林大学第一医院的临床实验室收集了CREC、产ESBL和非CREC、非ESBL的大肠杆菌菌株。所有临床分离株均通过Vitek-2 Compact自动化微生物分析仪和MALDI-TOF MS进行了重新鉴定。所收集的大肠杆菌菌株通过Vitek-2 Compact系统和Kirby-Bauer纸片扩散法进行了抗菌药物敏感性测试。
在本研究中，菌株分类定义为
菌株概述
使用Vitek-2 Compact自动化微生物分析系统重新确认和鉴定病原菌的临床分离株。共收集了154株临床大肠杆菌菌株，包括45株CREC、58株ESBL和51株非CREC、非ESBL菌株。154株大肠杆菌的抗菌药物敏感性结果详见表S3。在耐药菌株中，PCR检测出了23种耐药基因中的12种（见表1和S4，相应的电泳图见
讨论
本研究有几个创新方面：1）本研究结合了MALDI-TOF MS和ML来分类和鉴定携带NDM基因的CREC菌株。2）对特异性峰的来源进行了深入分析，确认m/z 5132和m/z 5209的峰来源于NDM基因的表达。这为使用MALDI-TOF MS技术进行耐药性检测提供了理论支持。3）协作基质的使用显著提高了
结论
本研究结合了协作基质、MALDI-TOF质谱和ML技术，成功建立了RF模型，并识别出m/z 5132、m/z 5209、m/z 6350和m/z 6371的特异性峰。这些峰与产生NDM的CREC分离株密切相关，表现出强大的区分能力。m/z 5132和m/z 5209的峰与CREC分离株中NDM基因的存在直接相关，能够准确预测产生NDM的CREC。
作者贡献
R.R.D.和Y.F.W.是本手稿的共同第一作者，对这项研究做出了同等贡献。
写作-初稿：R.R.D.；写作-审稿与编辑：J.C.X.、H.W.和X.H.G.；概念化：J.C.X.；调查：Y.F.W.和Q.Z.；方法学：Y.F.W.、R.R.D.、H.W.、J.Y.W.、L.S.和J.Y.W.；形式分析：X.F.J.、J.Y.W.和C.Y.；项目管理：J.C.X.和X.H.G.
所有作者均批准了提交的最终稿件，并同意对工作的所有方面负责。
致谢
本工作得到了中国吉林大学第一医院和中国科学院长春应用化学研究所的支持。
声明
资助：本工作得到了吉林省科技发展计划项目（20220401085YY）和中国国家自然科学基金（52373264）的支持。
利益冲突：作者声明没有与此工作相关的利益冲突。
伦理批准：本研究遵循世界医学协会的《赫尔辛基宣言》（1964年及其后续修订版）进行。第一医院的伦理委员会批准了这项研究。
