《International Journal of Biological Macromolecules》：Determination of the monosaccharide types and absolute configurations in polysaccharides with (
S)-(-)-1-phenylethylamine based on UPLC-MS/MS
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本研究开发了一种基于UPLC-ESI-MS/MS的手性衍生化分析方法，利用S-PEA试剂实现多糖单糖的D/L构型区分，解决了传统方法无法区分手性中心的难题。方法验证显示线性良好（R2＞0.9900），检测限低至0.04 μg/mL，回收率97.23%-100.67%，稳定性RSD＜3.54%。成功应用于6种植物多糖单糖组成分析，为多糖结构解析提供新工具。
Jie Bai|Yongchun Huang|Yuling Zhao|Lirong Zhang|Fuli Zhu|Yixizhuoma|Yuxin Weng|Shoude Zhang
青海大学药学院，中国青海省西宁市宁大路251号，810016
摘要
多糖的结构表征需要精确确定其单糖组成，包括区分D-构型和L-构型。现有的分析方法可以识别单糖类型，但往往无法区分对映异构构型，这对准确解析多糖结构构成了重大挑战。本研究介绍了一种稳健、准确且可重复的超高效液相色谱-电喷雾离子化-串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）方法来克服这一限制。通过使用(S)-(-)-1-苯乙胺（S-PEA）作为手性衍生化试剂，单糖对映异构体通过引入一个新的手性中心转化为非对映异构体。该方法能够同时测定醛糖、氨基糖、醛醇和尿苷酸的D/L构型，实现了出色的色谱基线分离。方法验证显示，在2.5–160 μg/mL的范围内具有优异的线性（R2 ≥ 0.9900）。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.04–0.11 μg/mL和0.13–0.35 μg/mL，表明该方法具有高灵敏度。准确度通过97.23%至100.67%的回收率得到确认，而日内和日间精度的RSD均低于3.54%。该方法成功应用于六种植物来源多糖的单糖组成分析，证明了其在识别结构类型和绝对构型方面的有效性。这些发现确立了所提出的方法作为推进多糖全面结构分析的宝贵工具。
引言
近年来，多糖因其低毒性和广泛的生物活性而受到广泛关注，包括免疫调节[1]、抗肿瘤作用[2][3][4]、抗炎特性[5][6]、抗凝活性[7][8]、抗菌作用[9]、抗衰老益处[10]、保肝作用[11]以及抗糖尿病特性[12][13]。多糖的单糖组成对其生物活性至关重要，因此准确分析对于理解其结构和活性关系非常重要[14][15]。精确识别单糖对于表征多糖性质是必不可少的。
目前，气相色谱-质谱（GC-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）是分析单糖组成的主要方法[16][17]。这些技术通常涉及多糖水解后进行衍生化以增强检测能力[18]。然而，大多数传统衍生化方法（如1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）[19]和糖氰醇酰化[20]）无法区分单糖的D-构型和L-构型，限制了它们在全面结构分析中的应用。准确识别单糖的绝对构型对于精确的组成表征至关重要。
单糖的绝对构型可以通过两种主要策略确定：使用手性色谱分离对映异构体，或将它们转化为可识别的非对映异构体衍生物[21]。此前，我们开发了一种结合L-半胱氨酸甲酯衍生化（CMED）与超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的方法，以同时确定多糖组成和D/L构型[22]。然而，所得Schiff碱衍生物的不稳定性限制了这种方法的应用。
作为替代方案，(S)-(-)-1-苯乙胺（S-PEA）被探索作为区分D/L构型的手性衍生化试剂。Noe等人应用S-PEA衍生化结合毛细管电泳实现了某些醛己糖和醛糖的四糖的部分分离[23]。然而，他们的方法存在显著缺点：适用范围狭窄，排除了尿苷酸、氨基糖和醛醇；并且毛细管电泳对单糖分析的灵敏度较低。
为了解决这些限制，本研究引入了一种改进的UPLC-ESI-MS/MS方法，该方法使用S-PEA衍生化，并结合氰硼氢化钠（NaBH?CN）将Schiff碱的碳-氮双键还原为稳定的碳-氮单键[24]。因此，主要目标是提高衍生物的稳定性，建立一种新的方法来确定单糖的D/L构型，并实现对醛糖、氨基糖、尿苷酸和醛醇的全面分析。此外，该研究还旨在阐明反应机制并表征潜在副产物，以确保方法的可靠性，并优化衍生化和色谱条件以获得最大的灵敏度和分离效率。该方法成功应用于六种植物来源多糖的单糖组成定性和定量分析，证明了其稳健性、灵敏度和在全面多糖结构分析中的适用性。
材料与试剂
D-阿拉伯糖（D-Ara）、L-阿拉伯糖（L-Ara）、D-核糖（D-Rib）、L-核糖（L-Rib）、D-木糖（D-Xyl）、L-木糖（L-Xyl）、D-葡萄糖（D-Glc）、L-葡萄糖（L-Glc）、D-半乳糖（D-Gal）、L-半乳糖（L-Gal）、D-甘露糖（D-Man）、L-甘露糖（L-Man）、D-岩藻糖（D-Fuc）、L-岩藻糖（L-Fuc）、L-鼠李糖（L-Rha）、D-葡糖醛酸（GlcA）、D-半乳糖醛酸（GalA）、D-葡萄糖胺盐酸盐（D-GlcN）、D-半乳糖胺盐酸盐（D-GalN）、D-甘露糖胺盐酸盐（D-ManN）、阿拉伯糖醇（Ara-ol）、木糖醇（Xyl-ol）
(S)-(-)-1-苯乙胺的衍生化机制和副产物分析
在本研究中，25种单糖通过两步过程用S-PEA进行衍生化。第一步是还原胺化，其中醛糖、氨基糖和尿苷酸的羰基与S-PEA反应形成Schiff碱，然后通过NaBH?CN还原为稳定的碳-氮单键。第二步，所有单糖（包括在第一步中不反应的醛醇）的羟基均用乙酸酐进行酰化（图1）。为了确认这一反应
结论
本研究建立了一种灵敏且具有立体选择性的UPLC-ESI-MS/MS方法，用于同时测定25种单糖，包括醛糖、氨基糖、醛醇和尿苷酸。通过使用S-PEA作为手性标记试剂，该方法克服了传统非手性测定的局限性，通过形成非对映异构体实现了D/L对映体的基线分离。衍生化反应机制得到了验证，特别指出
CRediT作者贡献声明
Jie Bai：撰写——初稿，数据管理。Yongchun Huang：撰写——审稿与编辑，方法学。Yuling Zhao：撰写——初稿，数据管理。Lirong Zhang：数据管理。Fuli Zhu：方法学。Yixizhuoma：指导，数据管理。Yuxin Weng：指导，方法学。Shoude Zhang：撰写——审稿与编辑，指导，资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
