基于结构的理性设计方法用于构建铁蛋白纳米笼，从而开发出具有热响应特性的通道，以实现药物封装过程的加速

《International Journal of Biological Macromolecules》：Structure-guided rational design of ferritin nanocages unlocks thermoresponsive channels for accelerated drug encapsulation

基于结构导向的突变策略可显著提升人铁蛋白重链（HFn）纳米笼的热响应通道扩张能力，使60℃下药物负载时间从4-6小时缩短至30分钟，同时保持pH响应释放和血脑屏障穿透特性。进一步整合RGD肽增强靶向性后，载药纳米笼在胶质瘤模型中展现出高效抑癌效果。

Hsiao-Ching Su|Chiun-Wei Huang|Sheng-Hung Wang|Chien-Yi Chang|Jia-Yu Lin|Yi-Hsiang Tseng|Hung-Hsiang Wu|Nan-Wei Su|Feng-Ting Huang

台湾国立大学生物化学科技系，台北，台湾

摘要

人铁蛋白重链（HFn）纳米笼由于其固有的生物相容性、明确的笼状结构以及通过转铁蛋白受体1（TfR1）介导的血脑屏障穿透能力，成为胶质母细胞瘤治疗的理想生物大分子载体。HFn纳米笼具有亚基间的通道，可以调节分子在蛋白质壳层中的传输。然而，有效的载荷加载通常需要在高温下长时间加热（4-6小时），这限制了其实际应用。本文报道了一种基于结构的理性设计策略，用于调节位于二重界面处的热响应通道。利用AlphaFold3进行计算建模，发现残基R43–D45是限制局部界面灵活性的氢键网络的关键稳定因子。将Asp44替换为丙氨酸（D44A）破坏了这一网络，增加了界面灵活性，同时保持了纳米笼的整体完整性。分子动力学模拟显示，该通道周围二重界面随温度变化而松弛，从而促进了载荷的瞬时进入。与这些预测一致，D44A变体在60°C下仅需30分钟即可实现约94个多柔比星分子的装载能力——而野生型HFn在相同条件下的装载能力明显较低。重要的是，这种修改在保持结构稳定性和pH响应释放特性的同时得以实现。进一步用RGD肽进行功能化后，增强了针对胶质母细胞瘤的细胞摄取能力，DOX负载的RGD–D44A纳米笼在体内表现出强大的抗肿瘤效果。综上所述，这些发现建立了一种基于理性突变的策略，用于微调通道附近的界面动力学，为热响应大分子载体的设计提供了通用框架。

引言

人铁蛋白重链（HFn）纳米笼由于其生物相容性、结构稳定性和肿瘤靶向能力，成为靶向药物递送的有希望的平台[1]、[2]、[3]、[4]。HFn由24个自组装的亚基组成，形成一个约12纳米的空腔笼，内部空间为8纳米，非常适合封装各种小分子[3]、[5]。此外，HFn对转铁蛋白受体1（TfR1）具有内在亲和力，而TfR1在包括胶质母细胞瘤在内的多种癌症中高度表达，这使得通过受体介导的内吞作用能够穿越血脑屏障（BBB）[6]、[7]、[8]。这些特性共同使HFn成为胶质母细胞瘤（GBM）靶向治疗的理想纳米平台。

尽管具有这些优势，但高效的药物加载仍然是临床应用的主要限制。传统的加载方法（如酸诱导解组装和重新组装，pH < 2）常常导致蛋白质不可逆损伤、回收率低以及酸敏感治疗药物的降解[9]、[10]。工程改造变体（如C端截短或AB环缺失）可以在较温和的条件下降低解组装的阈值，但往往会影响纳米笼的稳定性[11]、[12]、[13]。先前的研究表明，通过合理的界面工程可以实现对铁蛋白自组装的可逆控制。例如，在DE环引入组氨酸开关可以通过可逆解组装成四聚体来实现温和的封装[14]。其他方法，包括热处理、超声处理和表面活性剂辅助方法，也被探索用于提高封装效率[10]、[15]、[16]。其中，热调节特别有吸引力，因为短暂加热可以促进热响应通道的可逆打开。然而，要实现最大程度的封装通常需要在60°C下加热4-6小时，这既耗时又容易导致药物降解，从而限制了对敏感治疗药物的实际应用[15]、[17]。

为了克服这些限制，我们旨在开发一种基于结构的策略，以增强通道动力学而不破坏整体蛋白质结构，从而实现更快更高效的药物进入。通过AlphaFold3的结构建模和分子动力学（MD）模拟，确定了限制热响应通道瞬时扩展的关键亚基间相互作用，包括氢键和盐桥。引入突变以缓解这些限制并促进通道打开。为了评估工程纳米笼的体内递送能力，我们用整合素αvβ3靶向配体（RGD肽）对其进行功能化，以进一步增强肿瘤选择性摄取[5]、[18]、[19]。在细胞和小鼠模型中验证了工程纳米笼的有效性和靶向能力。

总之，本研究建立了一种基于理性的结构指导策略，用于调节HFn纳米笼中的通道动力学，加速了药物封装过程，为胶质母细胞瘤靶向治疗提供了有前景的平台（图1）。

材料

多柔比星盐酸盐（DOX，HY-15142）、RSL3（HY-100218A）和细胞计数试剂盒-8（CCK-8，HY-K0301）购自MedChemExpress（美国新泽西州蒙茅斯 Junction）。pET-28b(+)表达载体、Q5?定向突变试剂盒及相关分子生物学试剂购自New England Biolabs（美国马萨诸塞州Ipswich）。抗铁蛋白一抗（sc-376594）购自Santa Cruz Biotechnology（美国德克萨斯州达拉斯）。人胶质母细胞瘤细胞系U-87 MG和LN-18

基于结构的突变和热响应通道扩展的实验验证

铁蛋白亚基采用典型的四螺旋结构（A–D螺旋），C末端有一个长的BC环和一个短的E螺旋。两个亚基以反平行方向结合形成二重界面，其中包含一个热响应通道。该通道涉及一个亚基的残基43和89–92以及相邻亚基的残基79′和81′，其中残基79、81和89–92属于BC环，残基43–45属于AB环[15]。结构分析

结论

本研究表明，对铁蛋白进行理性单点突变（D44A）可以提高热响应性和通道灵活性，实现快速高效的药物封装，同时不损害结构稳定性。优化的RGD-44A纳米笼保留了铁蛋白的pH依赖性释放和受体介导的摄取能力，并在胶质母细胞瘤细胞中表现出显著的细胞毒性。在体内实验中，DOX@RGD-44A显著抑制了肿瘤生长，且全身副作用最小

CRediT作者贡献声明

Hsiao-Ching Su：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，方法学，研究，正式分析。Chiun-Wei Huang：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，监督，资源管理，项目管理，概念化。Sheng-Hung Wang：撰写 – 原稿，方法学，研究，正式分析。Chien-Yi Chang：验证，研究，正式分析。Jia-Yu Lin：验证，研究。Yi-Hsiang Tseng：

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢台湾国家科学技术委员会（NSTC）的财政支持，资助编号为NSTC 113-2320-B-002-018和NSTC 112-2320-B-002-025。

作者还感谢生命科学学院和NSTC资助的仪器中心（NSTC 114-2740-M-002-006）提供的技术支持（MRI和流式细胞仪-分选器）。