离轴照明与背向收集共聚焦布里渊散射显微光谱技术及其在生物组织粘弹性分析中的应用

《Analytical Chemistry》：Off-Axis Illumination and Epicollection Confocal Brillouin Scattering Microspectroscopy

本文报道了一种结合离轴照明与背向收集的共聚焦布里渊散射显微光谱（μCBS）新技术，通过有效抑制瑞利散射和杂散光背景，成功实现了在厚石英窗（1.25 mm）遮蔽下对牛血清白蛋白（BSA）水溶液（浓度高达20 wt%）的布里渊光谱测量。该技术为复杂结构中生物组织及体液（如血液、淋巴）的粘弹性（viscoelastic properties）无损检测提供了新方案，并首次发现水合水分子对蛋白质溶液布里渊谱线宽度的显著贡献。

　　

引言

自1922年L. Brillouin理论预言声子-光子散射以来，布里渊散射作为一种无需标记、无损的光谱分析手段，被广泛应用于局部热力学与力学性质研究。近二十年来，借助窄线宽激光器与法布里-珀罗干涉仪（FPI）或虚拟成像相位阵列（VIPA）光谱仪，通过布里渊频移变化可实现细胞与组织刚度的对比成像。共聚焦布里渊散射显微光谱（μCBS）进一步实现了三维力学成像，为研究生物组织功能与病理机制提供了新视角。然而，复杂组织界面产生的强瑞利散射及光学元件反射的杂散光严重干扰微弱的布里渊信号，限制了μCBS在深层组织中的应用。本文通过离轴照明与背向收集的光路设计，有效降低背景噪声，提升了μCBS在生物医学检测中的适用性。

实验方法

共聚焦布里渊散射显微光谱的光学系统

实验光路如图1所示，采用532 nm单频DPSS激光器，通过中性密度滤光片控制功率以避免样品过热。激光束经透镜组扩束后，由非偏振分光镜分为样品支路与参考支路，分别使用长工作距离物镜（NA=0.40，WD=20 mm）进行离轴照明与背向收集。为减少布里渊线宽展宽，将入射光束直径限制为2 mm（有效NA=0.1），使频移误差控制在±0.0026 GHz以内。散射光经共聚焦针孔（φ=50 μm）滤波后，由串联VIPA光谱仪（FSR 60 GHz与15 GHz）分光，sCMOS相机同步记录样品（BSA溶液）与参考（纯甲醇）信号。

离轴照明的空间分辨率与光通量评估

相较于满孔径照明，离轴照明下聚焦光斑直径₀与共聚焦长度₀分别增至3.39 μm与11.3 μm，空间分辨率约为轴向的1/2、纵向的1/4，光通量降至1/4。但该设计显著降低了界面反射杂散光，并通过虹膜光阑阻断非背向散射光（图2）。

参考支路的作用

参考支路同步监测甲醇的布里渊频移（约5.6 GHz）与线宽（约0.53 GHz），用于校准激光频率波动与仪器响应。通过公式Γ_B(sample_natural) = [Γ_B(sample_measured)/Γ_B(reference_measured)] × Γ_B(reference_natural)可计算样品本征线宽，提升数据可靠性。

共聚焦系统功能

共聚焦针孔主要滤除光路中的杂散光，而非提升空间分辨率。在离轴照明下，样品焦点体积较小（横向3.39 μm，纵向11.3 μm），针孔直径（50 μm）大于光束腰径（33.9 μm），故未削减光通量。

模型生物流体样品制备

以牛血清白蛋白（BSA）水溶液模拟生物体液（如淋巴中白蛋白浓度5.9–7.3 wt%），配置浓度0–20 wt%的溶液，并添加电解质（Na⁺150 mM, K⁺5 mM, Ca²⁺1.2 mM）及HEPES缓冲液调至pH 7.4，封装于1.25 mm厚石英比色皿中。

结果与讨论

背景抑制效果验证

对比图3中同轴与离轴照明下的sCMOS图像，离轴设计使水与甲醇的布里渊散射信号（斯托克斯与反斯托克斯峰）清晰可见，强瑞利散射背景被有效抑制。

光谱校准与数据分析

利用VIPA产生的多个瑞利散射点（间隔15 GHz）进行像素-频移非线性校准（二次函数拟合），获得失真较低的布里渊光谱（图4）。通过洛伦兹函数拟合布里渊峰，测得0 wt% BSA溶液的频移为7.53±0.090 GHz，线宽为0.801±0.026 GHz，与文献值一致。

BSA浓度依赖性与水合水贡献

如图6与表1所示，随BSA浓度增加，布里渊频移由7.57 GHz单调升至8.13 GHz，线宽由0.801 GHz增至1.232 GHz。参考甲醇信号保持稳定，验证系统可靠性。频移数据符合双相模型公式ν_B^eff(x) = ν_B^W√[1-x+x(V_W/V_S)²]，拟合得V_W/V_S≈1，表明蛋白质相与水相声速接近，反映BSA高度水合。线宽分析显示，简单粘性模型（Γ_B∝ν_B^eff2）在低浓度区偏离实验数据，而引入水合水贡献项（Γ_B= Aν_B^eff2+ Bx）后拟合优度显著提升（图7b），证实水合水分子通过弛豫效应增宽布里渊线宽。

结论

离轴照明与背向收集共聚焦μCBS技术有效降低了深层生物样品测量中的背景噪声，结合参考支路校准，提升了数据可靠性。在BSA溶液模型中，不仅验证了技术对遮蔽样品的检测能力，还揭示了水合水对粘弹性参数的不可忽略贡献。该技术为血液、淋巴等生物流体及复杂组织的无损力学分析提供了新工具，有望推动生物医学诊断与生化反应动态监测研究。