UltraPlex-TMT：通过正交蛋白酶酶切实现同标超多路复用的创新策略

《Journal of Proteome Research》：UltraPlex-TMT: Expanding Isobaric Hyperplexing via Orthogonal Protease Cleavage

本文提出了一种创新的高通量蛋白质组学策略UltraPlex-TMT，通过整合正交蛋白酶（LysC和TrypR）酶切与超多路TMT/TMTpro标记技术，成功实现了58重伪多路分析。该方法无需定制化学试剂或特殊仪器，在标准LC-MS平台上即可将样品通量提升一倍。研究证明该策略在蛋白质定量覆盖率（约9,000个蛋白质）、重复性（CV<10%）和准确性方面表现优异，且正交酶切不会引入系统性偏差。该工作流程为大规模队列研究和系统生物学应用提供了灵活可扩展的技术基础。

正交酶切策略的创新设计

研究团队开发了通过平行酶切产生非重叠肽段群体的正交酶切策略。蛋白质分别用LysC（切割赖氨酸C端）和TMT标记后仅切割精氨酸的Trypsin（TrypR）进行酶切，形成两个独立的子多重分析体系。通过煮沸和酸化方案验证了酶失活效率（仅约1%的残留活性），确保混合后无交叉酶切风险。

伪58重实验设计的实现

采用四种子多重分析组合（LysC-TMT11、LysC-TMT18、TrypR-TMT11、TrypR-TMT18），每个子集包含29个样品通道，最终形成58重伪多路分析体系。实验使用四种结肠癌细胞系（HT55、LS1034、MDST8、SW948）并以^E.coli蛋白作为内标，通过96孔板标准化流程（SimPLIT方法）完成样品制备。

酶切特异性与标记效率验证

质控数据显示LysC酶切产物中88%为赖氨酸特异性切割，TrypR组96%为精氨酸特异性切割，非特异性切割率均低于1%。TMT标记效率达到99.43%-99.97%，证明该方法具有高度可靠性。

蛋白质组覆盖度的深度评估

MS2采集在每个子多重分析中定量6,000-7,000个蛋白质，总覆盖度达9,122个蛋白质，其中4,429个（49%）为核心蛋白质组。RTS-MS3采集定量深度稍低（5,000-6,000个/子集），但各条件间重叠蛋白仍达3,268个（41%）。LysC酶切相比TrypR产生更多肽段，TMT18标记因总肽段载量更高而提升鉴定数。

定量一致性与准确性的系统评估

主成分分析表明生物学差异（细胞系）贡献99%以上方差，技术因素影响可忽略。MS2采集存在比率压缩（^E.coli标品log₂比率中位数0.57），而RTS-MS3显著提升准确性（中位数0.88）。值得注意的是，TMT18特有通道（132N-135N）因前体干扰较少而表现更优。

生物学一致性的验证

尽管MS2存在定量压缩，但基因集富集分析（GSEA）显示MS2与RTS-MS3数据在通路水平高度一致，证明MS2数据仍适用于大规模比较蛋白质组学。正交酶切未引入系统性偏差，支持其作为可靠的多重分析维度。

技术前景与优化方向

该方法可与TMTpro 35-plex或肽段条形码策略（如TAG-TMTpro）结合，潜在通量可达210重。当前RTS-MS3的深度限制可通过改进实时搜索算法优化，而MS2准确性可通过双隔离宽度采集（DIWA）或离子淌度技术提升。随着Orbitrap Astral等快速采集平台的普及，该方法有望实现亚分钟级样本分析速度。