《Journal of Cultural Heritage》：Dual-format indirect ELISA detection of food residues in late Roman and early medieval ceramics: Integrating antibodies and DNA aptamers for ancient protein and β-D-glucan analysis
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古代陶瓷烹饪残留物检测中aptamer-ELISA方法的灵敏度提升及多学科饮食重建研究，以斯洛文尼亚早中世纪遗址为例。
Janez Kosel | K. Patrick Fazioli | Andrej Magdi? | Zvezdana Modrijan | Jaroslav Pavelka | Polonca Ropret
斯洛文尼亚文化遗产保护研究所，保护中心，研究机构，卢布尔雅那，斯洛文尼亚
摘要
食物及其相关的物质文化为我们了解过去的社会世界提供了重要窗口，但从陶器上的有机残留物推断器皿的功能以及这些残留物的降解情况可能会阻碍对烹饪实践的考古研究。为了克服这些限制，我们应用了间接ELISA方法，结合使用多克隆抗体和合成适配体来检测来自斯洛文尼亚东北部两个山顶遗址的陶瓷碎片中的特定蛋白质和谷物多糖：一个是位于Ptuj城堡下方的早期中世纪定居点（公元7-9世纪），另一个是位于An?nikovo Gradi??e的晚期罗马-早期中世纪防御工事遗址（公元4-5世纪、7-10世纪）。含有烧焦烹饪残留物的陶片被研磨成粉末，并在MaxiSorp微孔板上检测六种蛋白质目标（卵白蛋白、溶菌酶、麸质、酪蛋白、胶原蛋白和肌球蛋白），以及(1→3)-β-D-葡聚糖目标，使用相应的初级抗体和生物素化DNA适配体进行检测。通过添加碱性磷酸酶偶联的二级抗体来标记初级抗体的结合，或添加碱性磷酸酶偶联的链霉亲和素来标记适配体的结合。在Ptuj遗址，两种方法都检测到了蛋类蛋白质、骨胶原蛋白、肌球蛋白和麸质；而适配体始终显示出比抗体更大的ΔOD值。在An?nikovo Gradi??e遗址，肉类残留物占主导地位：大多数晚期罗马时期的陶片上检测到了肌球蛋白和胶原蛋白，而陶片402（早期中世纪）则独特地检测到了谷物标记物——麦醇溶蛋白和β-D-葡聚糖，同时还检测到了肉类和蛋类蛋白质。酪蛋白仅出现在一个晚期罗马时期的器皿中。动物和植物残留物的共存表明可能存在炖菜或粥类等复合食物。我们的发现表明，基于适配体的ELISA方法对考古蛋白质具有更高的敏感性，蛋白质和多糖残留物的分析可以重建细致的饮食模式。这种方法在缺乏文字记录的背景下具有广泛的应用前景。但在试图从这一有限的数据集中推断更广泛的模式时需要谨慎。
引言
近年来，考古学界对食物社会性的兴趣显著增加，许多研究探讨了烹饪实践与经济、政治、种族、性别、意识形态、社会地位和宗教之间的相互作用。鉴于食物在文化中的普遍性及其相关物质文化在考古背景中的普遍存在，开发新的方法来研究过去的饮食实践至关重要[1]。
陶器在古代饮食中起着核心作用，承担着进食、饮用、储存和运输等功能。其形状和装饰反映了随着烹饪需求的变化和生产技术的进步而逐渐发展[2]。然而，当处理变形、烧焦或被喜旱微生物降解的有机痕迹时，推断器皿的功能仍然是一个重大挑战[3]。在历史背景下，书面资料通常可以澄清器皿的用途，但对于东南阿尔卑斯山和潘诺尼亚地区那些起源于过渡时期（晚期罗马、早期中世纪）的小型定居点来说，缺乏文字证据限制了饮食和社会经济生活的重建。然而，这些问题可以通过分层良好的考古背景和跨学科的科学方法来解决。
有机残留物分析直到最近才被应用于这些地理区域的陶瓷研究。传统上，东部阿尔卑斯山和北部亚得里亚海地区的饮食重建依赖于从单个遗址中恢复的动物和宏观植物遗骸[4,5]，并结合人类遗骸的同位素分析，以揭示C3植物与C4植物的消费情况以及陆地蛋白质与海洋蛋白质的相对贡献[6],[7],[8]。然而，有机残留物分析可以直接提供陶器中制备食物的证据。该地区最早的研究之一是对意大利东北部帕多瓦主教区（Padua）的早期中世纪陶器进行了研究，通过其生物标志物miliacin识别出了黍米（Panicum miliaceum）[9]。GC–MS脂质分析在45个被检测的器皿中有23个发现了残留物，其中约90%的阳性样本中含有miliacin，有时还伴随着动物脂肪、植物产品或蜂蜡。
虽然GC–MS脂质分析在残留物研究中占主导地位，但蛋白质和多糖分析提供了更高的组织和分类分辨率。古代蛋白质通过吸附到多孔基质（如陶瓷）上得以保存，这种保存得益于疏水相互作用、氢键和范德华力的作用。这使它们免受降解、微生物活动和浸出的影响[10]。与蛋白质类似，古代多糖也可以吸附并化学结合到矿物基质上，氢键、阳离子介导的桥接和表面复合作用降低了它们的溶解度和微生物的可及性，从而防止了酶促降解和浸出，同时也保护它们免受温度的破坏[11]。例如，Coulson-Thomas等人[11]报告称，当多糖受到矿物基质的保护时，可以保存数个世纪。酶联免疫吸附测定（ELISA）是目前最常用的蛋白质和多糖检测方法（无需昂贵的仪器），具有高灵敏度（低于1 ng；样品量仅需1-5 mg），其灵敏度超过了包括LC-MS/MS蛋白质组学在内的任何其他方法（后者需要至少100 mg的样品量[12]）。由于ELISA依赖于针对特定目标的多克隆抗体[13,14]，这些抗体可以结合多个表位，因此特别适合研究降解的古代分子。尽管针对动物目标分子的抗体在市场上容易获得，但针对植物目标分子的抗体仍然稀缺，通常只能在当地生产且不进行商业化销售。例如，针对黍米的抗体仅在研究环境中开发，但在市场上难以购买[15]。
为了克服这一限制，适配体——通过SELEX（系统进化富集法）生成的合成单链寡核苷酸——可以在室温下折叠成稳定的三维二级结构，从而能够与目标分子空间结合，因此成为抗体的一个有前景的替代品[16]。适配体几乎可以针对任何目标进行定制，包括那些不会引发免疫反应的物质，并且一旦其DNA寡核苷酸序列被公布，就可以低成本生产[17]。例如，针对(1→3)-β-D-大麦葡聚糖的适配体，其DNA序列已在相关研究中获得[18]。这些已发表或SELEX衍生的DNA寡核苷酸序列可以以相对较低的成本（每个适配体约40欧元）重复用于未来的化学合成。适配体可以在ELISA测试格式中替代抗体，为考古应用提供更具成本效益和可靠性的选择，我们的开创性研究最近证明了它们在分析陶器中结合的蛋白质方面的潜力[19]。
研究目的
本研究的目的是开发并验证一种双格式间接ELISA工作流程——同时使用多克隆抗体和生物素化DNA适配体——以灵敏地检测附着在中世纪和晚期罗马陶瓷碎片上的烧焦烹饪残留物中的六种与食物相关的蛋白质（卵白蛋白、溶菌酶、麸质、酪蛋白、胶原蛋白和肌球蛋白）以及谷物多糖(1→3)-β-D-葡聚糖。具体来说，我们试图：
比较检测限和ΔOD（信号与阈值）分离度
历史遗址和案例研究中的陶瓷发现
Ptuj的城堡山（北纬46°56′84″，东经15°65′19″；EID: 1–00,583）是一个多时期的考古遗址，最著名的是一个包含从8世纪末到11世纪末或12世纪初的墓地的早期中世纪墓地[20,21]。1946-1947年对该墓地及其相关的早期中世纪（可能是斯拉夫人居住的）定居点遗迹进行了发掘，其中包括两个该地区典型的烹饪灶台。20世纪80年代初的进一步发掘发现了更多的早期中世纪遗迹
结果与讨论
对于来自Ptuj的六个城堡山陶瓷碎片（公元7-9世纪），我们测试了基于抗体和适配体的ELISA方法，以比较三种蛋白质目标（蛋类蛋白质、麸质和胶原蛋白）的检测性能。在这六个被分析的碎片中，基于抗体和适配体的ELISA方法仅在一个样本中检测到了每个蛋白质目标的LOD以上；然而，适配体方法始终显示出更大的垂直分离度（ΔOD = OD样本 – LOD）[图4]。
对于蛋类蛋白质
结论
我们证明了结合生物素化DNA适配体的间接ELISA方法显著提高了对古代食物残留物的检测灵敏度。与传统的基于抗体的方法相比，适配体方法在蛋白质浓度较低时显示出更大的ΔOD值（卵白蛋白、溶菌酶、麸质和胶原蛋白）。早期中世纪Ptuj城堡的残留物分析显示了蛋类蛋白质和骨胶原蛋白的同时存在
