《Frontiers in Endocrinology》：Aerobic exercise and MOTS-c attenuate diabetic myocardial fibrosis via inhibition of the THBS1/TGF-β signaling pathway
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本综述揭示了有氧运动与线粒体衍生肽MOTS-c在改善2型糖尿病（T2DM）心肌纤维化中的关键作用。研究通过动物实验证实，两者均可显著改善糖脂代谢，抑制心脏胶原沉积，并增强心脏收缩与舒张功能。转录组学分析发现，其核心机制在于抑制血小板反应蛋白1（THBS1）/转化生长因子-β（TGF-β）信号通路。该研究为MOTS-c作为“运动模拟物（Exercise mimetics）”治疗糖尿病心肌病（DCM）提供了重要的理论依据。
1 引言
2型糖尿病（T2DM）是一个重大的国际健康问题，影响全球约5.37亿人，约占全球人口的10.5%。糖尿病心肌病（DCM）是其主要并发症之一，其特征是心脏性能的逐渐恶化，最终导致心力衰竭。DCM的关键病理特征包括左心室舒张功能受损、射血分数降低、心室肥厚和间质纤维化。在疾病进展中，纤维化起着关键作用，因此早期检测心肌纤维化并及时干预纤维化通路对于有效管理DCM至关重要。
体育运动通过增强胰岛素敏感性、降低血糖和胆固醇水平，在预防和管理DCM中扮演重要角色。运动还对糖尿病患者的心脏结构和功能产生积极影响，是临床管理DCM策略的关键组成部分。研究表明，DCM患者的耐力训练可以减轻左心室重构，改善心脏收缩和舒张功能，并增强线粒体功能、抗氧化能力和心肌细胞代谢。
MOTS-c是一种由线粒体12S rRNA基因编码的16氨基酸肽，于2015年被Lee发现。该肽从线粒体释放，通过血液循环到达各个器官，发挥全身性作用。MOTS-c主要存在于心肌、骨骼肌、血清和大脑中，作为一种重要的细胞保护剂。有趣的是，在运动过程中，MOTS-c的表达会增强，确保代谢平衡得以维持，保护线粒体免受损害，并支持整体细胞健康。无论是通过体育锻炼还是补充给药，MOTS-c都能触发机体的有益适应性反应。先前的研究证实，MOTS-c通过抗氧化、抗炎和减少氧化应激的机制来减轻糖尿病心肌损伤。这些结果表明MOTS-c具有复制运动诱导益处的显著能力，揭示了其在调节机体对体育运动的生理反应中的关键功能。该肽本质上作为一种运动模拟物（Exercise mimetics），在不需要实际体力消耗的情况下提供类似的优势。
尽管前期研究表明MOTS-c能复制运动对糖尿病大鼠心脏功能的积极影响，但其具体的分子机制仍不清楚。因此，本研究采用转录组学技术，旨在阐明MOTS-c减轻糖尿病条件下心肌瘢痕形成的具体过程，并评估不同八周干预措施对糖尿病诱导的心脏纤维化的影响，为糖尿病心肌病的治疗寻找有前景的靶点。
2 材料与方法
2.1 实验动物
研究使用了60只8周龄、体重180-200克的Sprague-Dawley大鼠，这些SPF级大鼠购自成都达硕实验动物技术有限公司。所有实验方案均经过成都体育学院实验动物伦理委员会审查批准。
2.2 实验分组
大鼠被分为两组：10只对照组和50只糖尿病前期组。糖尿病前期组大鼠经过7周高脂饮食喂养后，腹腔注射链脲佐菌素（STZ，30 mg/kg）以诱导糖尿病模型，对照组则注射等体积的柠檬酸钠缓冲液。72小时后测量血糖，血糖水平超过16.7 mmol/L被认为成功诱导糖尿病。成模后，50只糖尿病大鼠被随机分为4组：糖尿病组（D组）、糖尿病运动组（DE组）、糖尿病MOTS-c注射组（DM组）以及糖尿病运动结合MOTS-c组（DME组），另设正常对照组（C组），每组10只。
2.3 运动干预方案
DE组和DME组大鼠参照Bedford运动模型进行跑台训练。正式训练前有3天的适应性训练。正式干预为期8周，每周5天，每天以15米/分钟的速度训练60分钟。
2.4 MOTS-c注射干预
DM组和DME组大鼠通过腹腔注射MOTS-c，剂量为0.5 mg/kg/天，每周5次，持续8周。对照组注射等量的生理盐水。MOTS-c多肽由上海GL Biochem（成都）有限公司体外合成。
2.5 血糖、胰岛素水平和胰岛素抵抗评估
使用ACON Biotech的血糖仪测量空腹血糖（FBG）。使用ImmunoWay Biotechnology的大鼠ELISA试剂盒检测血清胰岛素（FINS）水平。采用HOMA-IR公式（空腹血糖×空腹胰岛素）/22.5评估胰岛素抵抗。
2.6 超声心动图
干预8周后，使用飞利浦CX50动物超声心动图仪评估心脏功能。测量参数包括左心室收缩末期内径（LVIDs）、左心室舒张末期内径（LVIDd）、左心室舒张末期后壁厚度（LVPWd）、射血分数（EF）、缩短分数（FS）、二尖瓣血流E/A峰值比值等。
2.7 样本采集
最后一次训练48小时后采集样本。大鼠用3%戊巴比妥钠麻醉后，采集主动脉血并分离血清。心脏组织迅速取出，部分用于组织学染色（HE染色和Masson染色），其余于-80°C保存用于后续分子生物学分析。
2.8 血脂分析
使用Mindray BS-280M全自动生化分析仪检测血清中甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和总胆固醇（TC）的水平。
2.9 HE染色和Masson染色
石蜡包埋的组织切片经过脱蜡、水化后进行HE染色和Masson染色，以观察心肌组织形态结构和胶原纤维沉积情况，并计算胶原容积分数（CVF）。
2.10 转录组与功能富集分析
提取组织mRNA进行转录组测序（Illumina平台）。通过设定校正p值<0.05且|log2FC|≥1.2筛选差异表达基因。使用clusterProfiler软件进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。
2.11 RNA提取与实时定量PCR（RT-qPCR）
使用Tiangen的DP419试剂盒提取总RNA，Thermo Fisher Scientific的RevertAid试剂盒合成cDNA。使用Bio-Rad CFX96系统和GoTaq实时PCR系统进行RT-qPCR，采用ΔΔCt法计算基因表达水平。
2.12 Western blotting
提取左心室组织蛋白，通过SDS-PAGE分离并转膜至PVDF膜。使用5%脱脂牛奶封闭后，与MOTS-c、THBS1、TGF-β和β-Actin的一抗4°C孵育过夜。使用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值。
2.13 统计分析
使用SPSS 25和GraphPad Prism 9进行数据分析。数据以均值±标准差表示。多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）或Kruskal-Wallis检验。p < 0.05认为有统计学意义。
3 结果
3.1 体重基础数据
与C组相比，D组大鼠体重显著降低18%，心脏重量指数增加约24%。DE组和DME组大鼠体重较D组显著增加。此外，DE、DM和DME组大鼠的心脏重量及心脏重量指数均较D组显著降低。
3.2 糖脂代谢
D组大鼠的空腹血糖（FBG）、HOMA-IR和总胆固醇（TC）水平显著高于C组，而高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和空腹胰岛素（FINS）水平显著降低。与D组相比，DE组大鼠的FBG、HOMA-IR和TC水平显著下降，HDL-C水平显著升高。DM组大鼠的HOMA-IR和TC水平显著降低。DME组大鼠的FBG、HOMA-IR和TC水平也显著下降。
3.3 心脏功能与形态结构
HE染色显示，C组大鼠心肌纤维排列整齐，细胞核染色质分布均匀，细胞外间隙小，微血管结构正常，成纤维细胞少，无炎性细胞浸润。D组大鼠心肌纤维排列紊乱，细胞肥大，细胞间隙增大，结构不清，并有炎性细胞浸润。经过运动、MOTS-c及其联合干预后，DE、DM和DME组大鼠的心肌纤维排列更为有序，未见明显炎性细胞浸润。
Masson染色显示，C组心脏组织中未检测到胶原纤维，而D组出现明显的胶原堆积，表明纤维化改变。DE、DM和DME组大鼠的心肌胶原沉积均显著减少。定量分析显示，D组的胶原容积分数（CVF）显著高于C组，而各干预组的CVF值较D组显著降低。
超声心动图分析显示，D组大鼠的左心室收缩功能明显受损，射血分数（EF）和缩短分数（FS）显著降低，左心室收缩末期内径（LVIDs）、左心室舒张末期后壁厚度（LVPWd）和收缩期后壁厚度（LVPWs）显著增加。在舒张功能方面，D组、DE组、DM组和DME组的左心室舒张末期内径（LVIDd）和E/A比值均与C组有显著差异。然而，DE、DM和DME组的E/A比值显著高于D组，表明舒张功能得到部分改善。
3.4 转录组分析与功能注释
转录组分析显示，糖尿病状态显著改变了328个基因的表达（167个上调，161个下调）。糖尿病大鼠进行有氧运动导致409个基因差异表达（188个上调，221个下调）。MOTS-c干预导致246个基因差异表达（196个上调，50个下调）。运动与MOTS-c联合干预导致480个差异表达基因（198个上调，282个下调）。
维恩图分析显示，DE组有97个基因发生改变，DM组有40个，DME组有69个。热图聚类分析表明，C组的基因表达模式与D组呈负相关，而DE、DM和DME组则表现出相似的上调和下调模式。
GO和KEGG富集分析显示，DE组中受影响的基因富集于代谢过程和细胞外基质（尤其是胶原）相关通路。DM组基因富集于成纤维细胞生长因子结合和受体相互作用等过程。DME组基因则富集于对成纤维细胞生长因子的细胞反应、成纤维细胞增殖、心脏形态发生和胶原结合等通路。
3.5 有氧运动和MOTS-c对THBS1/TGF-β信号通路的影响
3.5.1 THBS1表达水平检测
在功能富集分析中，THBS1被确定为一个关键基因。在糖尿病条件下，THBS1的表达显著上调。而在三种干预措施下，THBS1的表达均呈现一致的下调趋势。qRT-PCR分析证实，D组THBS1的mRNA水平显著升高，而DE、DM和DME组则显著降低。
3.5.2 THBS1、MOTS-c和TGF-β蛋白表达检测
Western blotting分析验证了蛋白表达水平。与C组相比，D组MOTS-c蛋白水平显著降低，而THBS1和TGF-β蛋白水平显著升高。经过有氧运动、MOTS-c及其联合干预后，DE、DM和DME组的MOTS-c蛋白水平有所升高（联合干预组尤为显著），而THBS1和TGF-β蛋白水平则显著降低。
4 讨论
4.1 MOTS-c与有氧运动对糖尿病心脏纤维化益处的比较
在2型糖尿病患者中，持续高血糖通过刺激心脏成纤维细胞增殖和增加心脏结构蛋白的产生，导致心肌纤维化，从而损害心脏功能。有氧运动通过改善糖脂代谢和保护心肌细胞结构来降低DCM风险。然而，运动疗法的依从性是一个重大挑战，许多患者难以坚持规律运动。因此，“运动模拟物”如MOTS-c，为无法坚持运动的人群提供了一种可行的替代或补充干预策略。
本研究结果表明，糖尿病大鼠表现为心肌纤维排列紊乱、胶原沉积增加、CVF升高，并伴有体重减轻、心脏重量指数增加以及FBG、HOMA-IR和TC水平升高。经过MOTS-c、有氧运动及其联合干预后，心肌纤维排列改善，胶原积累减少，糖脂代谢指标和心脏功能参数均得到显著改善。MOTS-c在改善糖脂代谢以及心脏结构和功能方面表现出与有氧运动相当的效果。转录组分析进一步揭示，三种干预方式分别调控了97、40和69个致病基因，其中 aerobic exercise和MOTS-c注射干预有16个重叠基因，三种干预方式共有11个共同基因。功能富集分析强调了MOTS-c与体育运动对糖尿病心肌纤维化具有可比性的影响。然而，联合治疗并未显示出相对于单一疗法的显著额外优势，这可能是因为MOTS-c和有氧运动激活的通路相似。
4.2 MOTS-c与有氧运动通过THBS1/TGF-β通路增强对糖尿病心肌纤维化的缓解作用
本研究证实，八周的有氧运动、MOTS-c或其联合干预能显著改善糖尿病大鼠的糖脂代谢，增强心肌结构和功能，并减少心脏组织纤维化。转录组学分析识别出THBS1是三种干预措施共同调控的关键基因，且其富集于纤维化相关通路。RT-qPCR和Western blotting验证了糖尿病大鼠中心肌THBS1 mRNA和蛋白表达上调，而干预后其表达受到抑制。THBS1水平与LVPWd和LVIDs呈正相关，与EF、FS和二尖瓣E/A比值呈负相关。糖尿病大鼠的高血糖和高TC水平可能通过上调THBS1诱导心脏结构改变，促进心肌纤维化并损害心功能。
TGF-β作为THBS1的下游介质，直接参与纤维化过程。我们的Western blotting结果显示TGF-β的表达模式与THBS1一致。有氧运动后，糖尿病大鼠的MOTS-c表达上调，提示MOTS-c/THBS1信号通路可能参与了减轻糖尿病心肌纤维化的过程。
在糖尿病心脏中，THBS1表达显著升高，促进间质纤维化。研究表明，THBS1通过其I型重复序列与TGF-β1的潜伏相关肽（LAP）结构域结合，激活TGF-β1，启动促肥厚反馈环路，加剧心脏重构。THBS1还可通过激活p38 MAPK磷酸化增加TGF-β1表达并抑制胶原酶活性，导致细胞外基质中胶原过度沉积。本实验结果支持这些发现，阐明了糖尿病中THBS1和TGF-β的激活，以及有氧运动和MOTS-c对两者表达的抑制作用，从而改善糖尿病心肌纤维化。
尽管TGF-β/Smad信号通路是公认的纤维化治疗靶点，但有研究指出，在糖尿病心肌病模型中，THBS1的缺失并未显著影响TGF-β/Smad通路，提示THBS1的促纤维化作用可能通过调节蛋白酶活性实现，独立于经典的TGF-β/Smad通路。因此，未来研究需要进一步探讨Smad信号级联反应，以明确MOTS-c在调节糖尿病患者心肌纤维化中的具体作用机制。
5 结论
为期八周的MOTS-c治疗、规律有氧运动及其联合干预能显著改善糖尿病大鼠的糖脂代谢，减少胶原积累，并显著增强心脏收缩和舒张功能。转录组学分析表明，干预措施调控了参与心肌纤维化通路的关键基因。有氧运动和MOTS-c很可能通过调节THBS1/TGF-β信号通路来减轻糖尿病心肌纤维化，这为开发新的治疗策略提供了重要的理论基础。
