单基因敲除RNLS与HIVEP2在β细胞球状体异种排斥中的局限性研究

《Frontiers in Immunology》：Single–gene knockout of RNLS or HIVEP2 are insufficient to protect β–cell spheroids from allo– and xeno–rejection

本研究通过CRISPR-Cas9技术敲除β细胞中的RNLS（肾胺酶）和HIVEP2（锌指转录因子）基因，系统评估其在异体移植（小鼠-小鼠）和异种移植（人-小鼠）模型中的免疫保护效果。结果表明，单基因编辑虽能有效降低基因表达，但无法延缓免疫健全宿主对β细胞球状体的排斥反应，提示临床移植需结合多基因编辑或免疫调节生物材料策略。（专业术语：CRISPR-Cas9、RNLS、HIVEP2、β细胞、异体移植、异种移植）

　　

引言

1型糖尿病（T1D）由胰岛β细胞自身免疫破坏引发，β细胞替代疗法虽具治愈潜力，但移植后易因异体或异种免疫排斥而失败。尽管全基因组CRISPR筛选已发现RNLS和HIVEP2基因可能保护β细胞免受自身免疫攻击，但其在异体/异种排斥中的作用尚不明确。本研究假设单基因敲除RNLS或HIVEP2可增强β细胞球状体在免疫健全宿主体内的存活能力。

方法

采用CRISPR-Cas9技术敲除小鼠β-TC-6和人EndoC-βH1细胞系的RNLS或HIVEP2基因，通过T7内切酶I assay和TIDE分析验证编辑效率。细胞通过琼脂糖悬浮培养形成均一尺寸（约150 μm）的球状体，并通过葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）评估功能完整性。将荧光素酶标记的球状体移植至CD-1小鼠皮下，通过生物发光成像（BLI）纵向监测移植物存活情况。

结果

基因编辑效率显著（HIVEP2敲除效率达94.3%），但功能检测显示：小鼠β-TC-6细胞中Rnls敲除导致GSIS刺激指数降低，而HIVEP2敲除未影响功能。体内实验表明，无论RNLS或HIVEP2敲除，异体移植（β-TC-6→CD-1）和异种移植（EndoC-βH1→CD-1）的移植物均在7-14天内被完全清除，排斥动力学与对照组无差异。异种移植排斥速度显著快于异体移植，且免疫缺陷小鼠（SCID）中移植物可长期存活，证实适应性免疫为主导排斥机制。

讨论

单基因敲除RNLS或HIVEP2虽能缓解自身免疫相关的应激通路（如RNLS调控内质网应激，HIVEP2抑制NF-κB炎症信号），但无法抵抗异体/异种排斥中更强的先天与适应性免疫反应。研究强调需结合多基因编辑（如HLA消除）、免疫调节生物材料（如PEG涂层、Treg工程化包裹）等组合策略，才能实现β细胞移植的长期免疫豁免。

技术亮点

本研究建立可扩展的琼脂糖悬浮球状体培养平台，确保高活力与尺寸均一性；通过跨物种（鼠/人）和移植模型（异体/异种）的平行对比，明确单基因编辑的局限性；结合体内外功能验证（GSIS、BLI成像），为后续组合疗法开发提供基准数据。