《Frontiers in Plant Science》：Development of KASP markers, SNP fingerprinting and population structure analysis of Robinia pseudoacacia and its closely related species
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本研究通过重测序筛选145个高质量SNP位点，成功开发31个核心KASP（竞争性等位基因特异性PCR）标记，对105份刺槐及其近缘种进行基因分型。结果显示标记多态性信息含量（PIC）达0.335，群体结构分析将材料分为3个亚群，并利用12个标记即可完全区分所有种质。该技术体系为刺槐种质鉴定、遗传多样性分析及分子育种提供了高效精准的工具。
引言
刺槐（Robinia pseudoacacia）作为具有重要生态与经济价值的落叶乔木，其种质鉴定长期依赖形态学标记和传统SSR（简单序列重复）技术，存在多态性低、操作繁琐等局限。本研究基于重测序数据筛选高质量SNP（单核苷酸多态性）位点，开发KASP（竞争性等位基因特异性PCR）标记，旨在构建刺槐DNA指纹图谱，解析群体遗传结构，为种质资源精准鉴定与分子育种提供技术支撑。
材料与方法
实验材料取自山东费县大青山国有林场的105份刺槐及其近缘种质。通过CTAB法提取DNA后，利用VCFtools对重测序SNP位点进行四轮筛选（MAF>0.05、缺失率<0.2、PIC>0.3、侧翼100 bp无变异），最终选定145个位点设计KASP引物。PCR反应体系包含特异性荧光探针，通过实时荧光检测系统完成基因分型。利用PowerMarker计算遗传参数，STRUCTURE分析群体结构，MEGA构建系统发育树。
结果
- 1.
标记开发与验证：145个SNP位点平均MAF（次要等位基因频率）为0.354，PIC为0.375。成功开发65个KASP标记，其中31个核心标记显示清晰分型簇，技术重复一致性达97%以上。
- 2.
遗传多样性：31个核心标记的PIC、MAF、杂合度与基因多样性均值分别为0.335、0.328、0.357和0.428，缺失率低于5%，符合高多态性标记标准。
- 3.
群体结构：Delta K峰值表明最佳分组数K=3（图4A），PCA与NJ树分析均支持105份材料分为Pop-1（23.9%）、Pop-2（39.0%）、Pop-3（37.1%）三个遗传群组（图4B、5），但群体间分化不明显，反映种质遗传背景相近。
- 4.
指纹图谱构建：基于12个核心KASP标记（如Rp7-3、Rp4-5等）即可完全区分所有种质（图6A）。指纹热图显示三对种质（NiuZhiCH/LYZBQS等）仅存在单一位点差异（图6C），与聚类分析结果一致。对30份未测序材料的验证表明指纹库鉴别率达100%。
讨论
相较于SSR标记，KASP技术具备通量高、成本低、稳定性强等优势。本研究开发的核心标记多态性水平与萝卜、甘蓝等作物报道相当，适用于刺槐种质资源管理。群体结构提示大青山林场刺种质遗传相似性高，可能与人工选育导致的遗传瓶颈有关。指纹图谱的建立为DUS（特异性、一致性、稳定性）测试体系优化奠定基础，但需通过多环境、多世代验证以提升应用可靠性。
结论
本研究成功构建刺槐KASP技术平台，实现种质快速精准鉴别。31个核心SNP标记为刺槐遗传资源保护、品种权验证及分子设计育种提供关键技术支撑。
