花生抗青枯病基因AhRRS6的图位克隆与功能解析

《Frontiers in Plant Science》：Positional cloning of a peanut CC-NBS-LRR gene, AhRRS6, confers resistance to Ralstonia solanacearum

本研究通过BSR-seq技术结合连锁作图，在花生中成功克隆了首个CC-NBS-LRR类抗青枯病基因AhRRS6，发现其等位基因AhRRS6y通过激活ETI/PTI免疫通路并增强抗氧化酶活性显著提升对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）的抗性，而AhRRS6x则导致感病性。研究不仅开发了可用于抗病育种的SNP分子标记，还系统揭示了花生抗青枯病的多通路调控网络，为作物抗病机制研究和抗病品种选育提供了重要遗传资源。

　　

1 引言

青枯病由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum, Rs）引起，是危害花生等经济作物的毁灭性土传病害，常导致10%–30%的产量损失。由于缺乏有效的化学防治手段，培育抗病品种成为最可行的防控策略。前期研究在花生中鉴定到多个与抗青枯病相关的数量性状位点（QTL），如位于染色体B02的qBWRB02.1和染色体12的1.8–9.0 Mb区域，但关键抗病基因的功能尚未通过图位克隆验证。植物免疫系统包含由模式触发免疫（PTI）和效应子触发免疫（ETI）构成的多层防御网络，其中NLR（核苷酸结合富亮氨酸重复受体）基因是ETI的核心组件。近年来，集团分离子转录组测序（BSR-seq）技术因其能够快速定位表达基因相关的QTL，在作物抗病基因挖掘中展现出优势。

2 材料与方法

研究以抗病品种“粤油92”（YY92）和感病品种“新会小粒”（XHXL）为亲本，构建包含581个F₁₃代重组自交系（RIL）的群体。通过田间人工接种Rs并计算病情指数（DI），筛选极端抗/感池进行BSR-seq分析。利用Illumina HiSeq平台对亲本及抗/感池进行转录组测序，获得总计189.6 Gb的高质量数据，检测到70,035个高质量SNP。通过ΔSNP-index和欧几里得距离（ED）算法关联分析，结合传统QTL作图，定位抗病QTL区间。对候选基因进行克隆、转基因功能验证，并测定丙二醛（MDA）含量和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性以评估氧化损伤程度。

3 结果

3.1 表型变异与转录组测序

RIL群体DI呈连续分布，表明青枯病抗性为数量遗传性状。基于极端表型构建的抗池（DI 10.22%–20.00%）和感池（DI 81.68%–92.79%）用于BSR-seq，测序数据质量高（Q30 > 85.02%），比对至参考基因组“石头奇”的比对率达78.17%–81.07%。

3.2 SNP检测与候选区域鉴定

ΔSNP-index和ED分析共同定位到染色体12上两个关键QTL区间：1.11 Mb（1,763,660–2,877,695 bp）和1.03 Mb（3,665,856–4,691,788 bp）。QTL作图进一步验证后者为稳定主效QTL（LOD=44.62，贡献率42.81%）。区间内共筛选出187个基因，包括60个NBS-LRR基因，其中5个（AH12G01180、AH12G01230等）因存在非同义突变被列为候选基因。

3.3 SNP标记验证

通过全基因组重测序验证11个候选SNP位点，发现Chr12-1931823、Chr12-1932270（位于AH12G01230）和Chr12-2432994（位于AH12G01510）在10个抗病品种中与抗病亲本基因型一致，可作为抗病育种的分子标记。

3.4 差异表达基因与通路富集

Rs胁迫下，抗病材料中9,303个基因差异表达，其中ETI相关NBS-LRR基因、PTI相关NDR1基因、丝氨酸/苏氨酸激酶（STK）、WRKY和NAC转录因子等防御通路基因显著上调。qRT-PCR验证了WRKY70、SBT2.5等关键基因的表达模式。

3.5 AhRRS6克隆与亚细胞定位

从AH12G01230位点克隆得到CC-NBS-LRR类基因AhRRS6，其抗病等位基因AhRRS6y和感病等位基因AhRRS6y存在6个SNP差异，导致CC和NB-ARC结构域4个氨基酸替换。表达分析显示AhRRS6y在Rs接种后6 h显著诱导表达，而AhRRS6x无响应。亚细胞定位表明AhRRS6蛋白定位于细胞膜和细胞质。

3.6 转基因验证抗病功能

在本氏烟（Nicotiana benthamiana）和拟南芥中过表达AhRRS6y显著降低病害指数和菌量，而AhRRS6x过表达植株与野生型均表现感病。qRT-PCR显示AhRRS6y激活ETI标志基因（NbEDS1、NbHSR203J）、PTI通路基因及SA途径基因NbPR1，同时抑制JA通路基因NbPDF1.2；AhRRS6x则相反。

3.7 氧化应激响应

Rs接种后，AhRRS6y过表达植株MDA积累量最低，APX活性最高，表明其通过增强抗氧化能力减轻膜脂过氧化损伤，而AhRRS6x植株氧化损伤严重。

4 讨论

BSR-seq技术高效定位了花生抗青枯病QTL，并直接克隆到关键基因AhRRS6。染色体12上1.11 Mb区间为新的抗病位点，而1.03 Mb区间与前期报道一致。AhRRS6作为典型的CNL蛋白，其等位基因差异通过影响CC和NB-ARC结构域功能，导致抗感表型分化。转基因实验证实AhRRS6y通过协同调控ETI、PTI、MAPK、Ca²⁺信号通路及WRKY/NAC转录因子网络，增强植株免疫反应。此外，AhRRS6y通过维持高APX活性和低MDA水平，有效缓解氧化损伤，提升抗病性。

5 结论

本研究首次通过图位克隆获得花生中CC-NBS-LRR类抗青枯病基因AhRRS6，明确AhRRS6y等位基因的抗病功能及分子机制，开发了可用于分子育种的SNP标记。结果揭示了花生通过多重免疫通路应答Rs入侵的调控网络，为抗病品种选育和作物免疫机制研究提供了理论基础。