《Marine Life Science & Technology》：Caspase-mediated interleukin-18 maturation promotes membrane-associated unconventional secretion and signal transduction in a teleost fish
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本研究揭示了硬骨鱼类半滑舌鳎中白细胞介素-18（IL-18）的新型成熟与分泌机制。研究人员发现其前体可被caspase-1/3/6/7在不同位点切割产生三种活性形式，并通过静电作用靶向细胞膜，以微囊泡形式分泌。活性IL-18与受体IL-18Rα/β形成复合物激活信号通路，显著增强抗菌免疫并降低感染死亡率，为鱼类免疫调控提供了新视角。
在先天免疫系统中，白细胞介素-18（IL-18）作为重要的促炎细胞因子，在抵抗病原体感染过程中发挥着核心作用。与大多数细胞因子不同，IL-18以其无活性的前体形式（pro-IL-18）合成，必须经过蛋白水解切割成熟后才能发挥功能。在哺乳动物中，这一成熟过程主要由炎症小体激活的caspase-1介导。然而，在进化地位上更古老的硬骨鱼类中，IL-18的成熟、分泌及免疫调控机制长期以来笼罩在迷雾之中。尤其值得注意的是，硬骨鱼类IL-18缺乏哺乳动物中保守的caspase-1识别基序，这暗示着其可能存在独特的活化途径。此外，作为一种缺乏内质网信号肽的细胞因子，IL-18无法通过经典的ER-Golgi途径分泌，其“非常规分泌”的具体机制在鱼类中更是知之甚少。这些知识空白限制了我们对于早期脊椎动物免疫系统运作方式的理解。为了解决这些问题，研究人员以半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）为模型，开展了一项深入研究。
为了阐明半滑舌鳎IL-18的生物学特性，研究人员首先进行了生物信息学分析。系统进化分析表明，IL-18在硬骨鱼类乃至四足动物中广泛存在，但其氨基酸序列同源性较低，提示其功能可能通过相对保守的三维结构来维持。同源建模显示，半滑舌鳎IL-18与人类IL-18一样，具有典型的β-三叶草结构，由两股α螺旋和三组扭曲的反平行β片层构成。然而，关键的差异在于其N端前肽序列，哺乳动物中caspase-1识别的“LESD”基序在舌鳎IL-18中并不保守，预示着其成熟机制可能与众不同。
研究的核心发现在于揭示了半滑舌鳎pro-IL-18可被多种caspase切割激活。令人惊讶的是，除了经典的炎症相关caspase-1外，通常与细胞凋亡相关的caspase-3/7和caspase-6也能有效切割pro-IL-18。通过点突变实验，研究人员精确鉴定出了三个切割位点：caspase-1作用于“YFED”基序中的天冬氨酸46（D46），产生Δ46形式的成熟IL-18；caspase-3/7作用于“DNID”基序中的D49，产生Δ49形式；而caspase-6则作用于“SFTD”基序中的D55，产生Δ55形式。这就产生了三种不同长度的成熟IL-18蛋白。
这种切割过程带来了一个关键的物理化学变化：电荷反转。pro-IL-18的等电点（pI）预测为5.75，整体带负电。而切割掉富含酸性氨基酸的N端前肽后，三种成熟形式（Δ46, Δ49, Δ55）的pI分别升至6.65, 7.13和8.11，转变为带正电的分子。研究人员推测，这种电荷变化可能影响其亚细胞定位。果然，细胞实验证实，带负电的pro-IL-18主要分散在细胞质中，而带正电的成熟IL-18（尤其是pI最高的Δ55形式）则能通过静电吸引富集在带负电的细胞膜磷脂内叶上。进一步观察发现，这些膜结合的IL-18能被包裹在膜衍生的微囊泡中，随后被分泌到细胞外。这一发现揭示了半滑舌鳎IL-18的一种新的、不依赖于细胞裂解的非常规分泌途径——即通过 caspase介导的成熟导致电荷反转，进而驱动其膜靶向和微囊泡分泌。
分泌到细胞外的成熟IL-18如何启动信号传导？研究人员接着解析了其与受体的相互作用。他们在半滑舌鳎中鉴定出了IL-18受体α亚基（IL-18Rα）和β亚基（IL-18Rβ）。共聚焦显微镜和免疫共沉淀实验清晰地表明，成熟的IL-18（Δ46, Δ49, Δ55）能特异性地与细胞膜上的IL-18Rα结合，而pro-IL-18则不能。结合后，IL-18/IL-18Rα异源二聚体会进一步招募IL-18Rβ，形成有功能的异源三聚体复合物（IL-18/IL-18Rα/IL-18Rβ），这与哺乳动物中的模式相似。Δ55形式的IL-18与受体的结合能力最强，再次凸显了正电荷在相互作用中的重要性。
那么，这条信号通路在抗感染免疫中究竟扮演什么角色？功能实验给出了答案。用重组成熟IL-18刺激半滑舌鳎外周血白细胞，能显著上调干扰素-γ（IFN-γ）、IL-1β和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等关键促炎细胞因子的表达，而pro-IL-18则无此活性，证明了成熟IL-18的生物活性。用哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）感染半滑舌鳎后，其在脾脏、外周血白细胞、头肾和肝脏等重要免疫器官中的IL-18表达量显著升高。更重要的是，在感染动物的血清中检测到了被加工成熟的IL-18蛋白，且其含量随时间推移而增加，证实细菌感染确实在体内诱导了IL-18的成熟和分泌。最关键的是，体内保护实验显示，预先注射成熟IL-18（Δ49形式）能显著提高半滑舌鳎在哈维氏弧菌攻击下的存活率，并减轻感染导致的组织损伤（如肌肉坏死、皮肤溃疡等）临床症状。这充分证明了IL-18信号通路在增强鱼类抗菌免疫力、改善感染预后方面的关键作用。
本研究主要应用了以下关键技术方法：基因克隆与点突变技术用于构建各种IL-18及其受体表达载体；原核表达系统用于重组蛋白的制备与纯化；体外酶切反应结合蛋白质免疫印迹（Western Blot）用于分析caspase对IL-18的切割特异性；细胞转染、亚细胞组分分离、免疫荧光共聚焦显微镜技术用于蛋白定位与相互作用研究；免疫共沉淀（Co-IP）验证蛋白质相互作用；实时定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达水平；以及哈维氏弧菌感染半滑舌鳎的动物模型（动物来自山东本地渔场）用于体内功能验证。
结果
半滑舌鳎IL-18的结构与系统进化分析
研究成功鉴定出半滑舌鳎IL-18同源物，其与脊椎动物同源物序列一致性较低（23-32%），且缺乏哺乳动物中保守的caspase-1识别基序“LESD”。然而，结构建模显示其具有保守的β-三叶草结构。系统进化分析将舌鳎IL-18与其他硬骨鱼类IL-18聚为一支，并与四足动物IL-18形成更大分支，区别于IL-1β、IL-1α和IL-33。
pro-IL-18被caspase-1/3/6/7蛋白水解激活，产生三种成熟IL-18形式
体外实验证实，半滑舌鳎pro-IL-18可被人源及舌鳎自身的caspase-1、caspase-3/7和caspase-6切割，而caspase-8则不能。点突变分析确定了三个切割位点：caspase-1作用于D46，caspase-3/7作用于D49，caspase-6作用于D55，从而产生分别缺失46、49或55个N端氨基酸的成熟IL-18（Δ46, Δ49, Δ55）。
IL-18成熟足以实现膜转位和微囊泡介导的非常规分泌
成熟过程移除了pro-IL-18 N端的负电荷区域，使其表面电势由负转正。细胞实验表明，带正电的成熟IL-18（尤其是Δ55）能富集于细胞膜，并被包裹进膜衍生微囊泡中分泌到细胞外，而pro-IL-18则主要滞留于胞质。分泌实验证实成熟IL-18的分泌效率高于其前体。
IL-18Rα特异性识别成熟IL-18并招募IL-18Rβ
舌鳎IL-18Rα和IL-18Rβ定位于细胞膜。成熟IL-18能特异性地与IL-18Rα结合，并进一步招募IL-18Rβ形成异源三聚体复合物，而pro-IL-18不能结合IL-18Rα。IL-18Rβ不能直接结合IL-18。
IL-18在感染期间激活抗菌免疫反应
舌鳎IL-18在免疫相关组织（如外周血白细胞、脾脏）中高表达。哈维氏弧菌感染能诱导其表达上调及成熟分泌。体外细胞刺激实验表明，成熟IL-18能显著诱导IFN-γ、IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子的表达。体内实验证明，注射成熟IL-18能激活IL-18信号通路，显著增强机体对哈维氏弧菌的清除能力，降低感染引起的死亡率。
结论与讨论
本研究系统阐明了半滑舌鳎IL-18从成熟、分泌到受体识别及信号激活的全过程，揭示了一种不同于哺乳动物的、独特的caspase介导的IL-18成熟与非常规分泌机制。其主要意义在于：首先，发现caspase-3/7和caspase-6在鱼类中不仅能切割灭活某些细胞因子，反而可以激活IL-18，拓展了对凋亡相关caspase免疫调节功能的认识。其次，揭示了IL-18成熟导致的电荷反转是其靶向细胞膜并通过微囊泡分泌的关键驱动力，为理解缺乏信号肽的细胞因子的分泌机制提供了新范式。再者，证实了IL-18/IL-18Rα/IL-18Rβ信号通路在硬骨鱼类抗细菌感染免疫中的核心作用，表明其功能在进化上是保守的。该研究不仅深化了对早期脊椎动物免疫系统，特别是细胞因子调节网络的理解，也为鱼类病害的免疫防控策略开发提供了新的理论靶点。论文发表于《Marine Life Science》期刊。
