真菌杂合聚酮合酶PbPKS1的发现揭示非经典部分还原型PKS采用NR-PKS样组装机制

《Marine Life Science & Technology》：A hybrid assembly mechanism employs nonreducing polyketide synthase-like logic for partially reduced polyketide formation

本研究针对真菌迭代型I聚酮合酶分类界限明确但多样性未被充分认知的问题，通过挖掘海洋真菌Penicillium brocae HDN12-143基因组，发现具有KR-KS-AT-PT-ACP1-ACP2-CMeT-TE非典型结构域的PbPKS1。体内外实验证实其能以NR-PKS样机制（PT域介导环化、TE域释放产物）合成Cα-甲基化部分还原聚酮化合物，系统发育分析定义其为源于NR-PKS重组演变的新家族nPR-PKS。该研究突破了真菌iPKS三分法的传统认知，为聚酮生物合成进化提供了新范式。

　　

在真菌的次级代谢产物合成体系中，迭代型I聚酮合酶如同精密的分子工厂，通过反复调用同一组催化结构域，高效构建出结构多样且具有显著生物活性的聚酮类化合物。根据其结构域组成和还原程度，这类酶被划分为三大经典类型：高度还原型、部分还原型和非还原型聚酮合酶，它们各自拥有清晰的催化逻辑和产物谱系。然而，随着基因组测序技术的飞速发展，研究人员逐渐意识到，真菌iPKS的多样性远超出既往认知，其分类边界可能存在未被探索的灰色地带。

正是在此背景下，一项发表于《Marine Life Science》的研究带来了突破性发现。研究人员从一株海洋来源的青霉Penicillium brocae HDN12-143中，鉴定出一个名为PbPKS1的聚酮合酶基因。该酶展现出前所未有的KR-KS-AT-PT-ACP₁-ACP₂-CMeT-TE结构域排列顺序，与任何已知类别的iPKS均不相同。这种独特的“混搭”结构预示着其可能采用一种全新的聚酮链组装机制。

为揭示PbPKS1的功能，研究团队运用了多项关键技术：通过异源表达技术在模式宿主菌Aspergillus nidulans LO8030中实现PbPKS1的表达，并利用液相色谱-质谱联用技术分析产物；采用体外酶学重构实验，将PbPKS1分割表达为多个功能片段，在试管中重现其催化过程；通过点突变和结构域互补实验验证PT域和TE域的具体功能；还利用结构域替换策略，将PbPKS1的PT域与已知NR-PKS OrsA的对应结构域进行功能互换；最后，基于最大似然法构建系统发育树，分析KS和KR结构域的进化关系。

发现和功能验证PbPKS1

研究首先通过基因组挖掘在Penicillium brocae HDN12-143中鉴定出PbPKS1基因。异源表达结果表明，该酶能催化产生两种单羟基苯甲酸和两种吡喃酮类化合物。这些产物结构特征表明，PbPKS1能够合成经过Cα-甲基化修饰的部分还原型聚酮化合物。

PbPKS1-DH域介导1a和1b的环化*

深入研究发现，PbPKS1中原本被注释为DH（脱水酶）的结构域实际上与NR-PKS中的PT（产物模板）域同源。点突变实验显示，将该域中保守的组氨酸残基H₁₄₄₆突变为丙氨酸后，芳香族产物的合成完全终止。更为关键的是，在体外实验中，PbPKS1的PT域能够成功替换典型NR-PKS OrsA中的PT域，并催化相同的C2-C7环化反应，证明其具有典型的醛醇环化酶功能。

PbPKS1-TE域负责1a/1b的水解释放和2a/2b的内酯化

对C末端的硫酯酶域功能研究表明，突变其保守的丝氨酸残基S₂₄₈₇会导致所有产物消失，而回补野生型TE域则可恢复生产。这表明PbPKS1-TE域具有双重功能：既能水解芳香族产物的硫酯键，又能催化吡喃酮产物的内酯化环化，这一特性在已知iPKS中较为罕见。

提出的PbPKS1组装机制

基于上述发现，研究提出了PbPKS1的催化模型：起始单元加载后，经过两轮链延伸，在第二轮延伸时，KR域选择性还原羰基，CMeT域催化Cα-甲基化，PT域介导芳香环形成，最后由TE域释放产物。而吡喃酮类产物可能是链延伸过程中提前释放的副产物。

nPR-PKS的分化和进化

系统发育分析显示，PbPKS1及其同源酶的KS结构域与NR-PKS亲缘关系更近，而KR结构域则与经典PR-PKS的KR域聚为一类。这表明nPR-PKS可能起源于NR-PKS，通过基因重组事件，用KR结构域替换了NR-PKS特有的SAT（起始单元酰基转移酶）结构域，从而形成了这一新的iPKS家族。

综上所述，这项研究不仅发现了一类全新的真菌迭代型聚酮合酶nPR-PKS，更重要的是揭示了其独特的杂合组装机制：它采用NR-PKS典型的PT域环化和TE域释放策略，却能够产生部分还原型聚酮产物。这一发现打破了长期以来对真菌iPKS分类的固有认知，证明了结构域重组是PKS功能进化的重要驱动力。nPR-PKS的发现为理解聚酮合酶的进化提供了新视角，也为通过合成生物学手段设计新型聚酮化合物开辟了新途径。