糖尿病胰腺癌中CAF来源CXCL12介导的肿瘤内适应性免疫功能障碍机制研究

《Cellular Oncology》：CXCL12 derived from cancer-associated fibroblasts mediates dysfunctional intratumoral adaptive immunity in diabetic pancreatic adenocarcinoma

本研究揭示了糖尿病（DM）胰腺导管腺癌（PAAD）中癌症相关成纤维细胞（CAF）来源的CXCL12通过诱导CD22+B细胞和TIGIT+CD8+T细胞的免疫抑制表型转化，导致肿瘤内适应性免疫功能失调的分子机制。研究结合多算法免疫浸润分析、临床样本验证及体内外实验，证实阻断CXCL12-CXCR4轴可逆转免疫抑制微环境，为糖尿病相关胰腺癌的免疫治疗提供新靶点。

　　

背景

糖尿病（DM）与胰腺导管腺癌（PAAD）的发生发展密切相关，但DM相关PAAD的免疫特征尚不明确。本研究旨在阐明糖尿病PAAD的免疫景观及其潜在机制。

方法

通过TCGA数据库和原代分选CAF的RNA测序数据筛选差异表达基因（DEG），并进行富集分析。应用xCell、Timer、Estimate、Quantiseq和MCPcounter算法评估肿瘤内免疫浸润，同时通过临床样本的多色免疫荧光验证。体外实验包括增殖实验和免疫表型鉴定，验证关键基因对免疫重编程的影响。构建胰腺星状细胞（PSC）与胰腺癌细胞混合注射的动物模型，验证糖尿病胰腺癌中相关通路的体内效应。

结果

筛选的DEG富集于多个免疫调节通路。糖尿病胰腺癌的免疫力表现为看似旺盛但功能缺陷，以CD22⁺B细胞和TIGIT⁺CD8⁺T细胞为特征。相关性分析表明，CXCL12与B细胞和CD8⁺T细胞的丰度及免疫表型转化显著相关，多个算法结果一致。在糖尿病PAAD患者和小鼠中检测到更多CXCL12^HighCAF。同时，CXCL12^HighPSC处理在体外和体内实验中均促进B细胞和CD8⁺T细胞的免疫抑制表型，而plerixafor阻断CXCL12-CXCR4轴在皮下肿瘤模型中显示治疗效果。

结论

本研究描绘了糖尿病PAAD个体中CAF来源的CXCL12介导的独特免疫抑制景观，有助于指导治疗决策和预测免疫治疗反应。

糖尿病PAAD中免疫细胞丰度和表型的差异

通过TCGA数据库筛选DEG，发现255个上调基因和26个下调基因。富集分析显示这些基因功能主要集中于免疫信号通路，包括B细胞和T细胞的激活过程及内部调节。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析识别出七个MCODE复合物，其中绿色和红色MCODE分别代表B细胞和T细胞受体信号通路。xCell算法显示，与非糖尿病组相比，糖尿病PAAD样本中的树突状细胞（DC）、B细胞和CD8⁺T细胞显著增加，免疫评分更高。免疫表型分析发现PDCD1、BTLA、EOMES、CD22、CTLA4、TIGIT和Foxp3等免疫抑制标志物表达升高。CD22与B细胞标志物（CD19、MS4A1、CD79A、CD79B）强相关，TIGIT与CD8⁺T细胞标志物密切相关。单细胞图谱显示CD22主要作用于B细胞功能，TIGIT作用于NK细胞和T细胞。

肿瘤内免疫抑制性适应性免疫细胞分布增加

多色免疫荧光显示，糖尿病PAAD临床肿瘤样本中CD22⁺CD19⁺B细胞和TIGIT⁺CD8⁺T细胞百分比显著增加，表明其向免疫抑制表型转化。糖尿病组中浸润的CD19⁺B细胞和CD8⁺T细胞更多。在BKS-DB自发性糖尿病小鼠模型中，皮下肿瘤模型显示CD22⁺B细胞百分比显著升高，且为CD86^Low非活性状态；CD8⁺T细胞的平均TIGIT强度增加2.51倍。这些结果表明糖尿病PAAD呈现免疫缺陷景观。

排序CAF的RNA测序分析

空间转录组分析显示B细胞和CD8⁺T细胞主要分布于癌症的基质区。CAF作为主要基质成分，与肿瘤浸润免疫细胞存在复杂相互作用。糖尿病PAAD个体中基质评分随免疫评分显著增加。对BKS-WT和BKS-DB小鼠皮下肿瘤排序的CAF进行RNA测序，发现3979个DEG，包括1990个上调和1989个下调基因。富集分析显示这些基因富集于细胞-细胞信号、炎症反应、细胞因子-细胞因子受体相互作用和TNF信号通路等。Reactome数据库富集分析表明细胞因子信号在免疫系统通路中活跃参与CAF介导的DM相关PAAD改变。

过表达CXCL12与糖尿病PAAD免疫重编程相关

通过TCGA数据库和CAF RNA测序数据的DEG集进行Venn分析，获得40个重叠DEG。富集和PPI分析证实这些基因功能富集于免疫通路，包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、滤泡外和滤泡B细胞激活。应用xCell、Quantiseq、Timer、MCPcounter和Estimate算法评估免疫亚群丰度，发现CXCL12与B细胞和CD8⁺T细胞丰度呈正相关，且与免疫抑制标志物CD22和TIGIT正相关。生存分析显示糖尿病PAAD个体中较高CXCL12表达与较短中位总生存期（OS）相关。机制上，糖尿病特征如晚期糖基化终末产物（AGE）-晚期糖基化终末产物受体（RAGE）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）-IGF-1受体（IGF-1R）通路激活、高胰岛素血症和过量活性氧（ROS）参与CXCL12表达调控。外源性AGE、IGF-1和H₂O₂处理可升高小鼠PSC（mPSC）的CXCL12水平，而FPS-ZM1、JB-1和N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制分别逆转此效应。

糖尿病PAAD中CXCL12^HighCAF分布升高

多色免疫荧光显示，糖尿病PAAD患者肿瘤样本中结蛋白（Desmin）标记的基质较厚，每个Desmin⁺细胞的CXCL12强度显著增加。BKS-DB小鼠皮下肿瘤模型内肿瘤CXCL12浓度是BKS-WT组的1.63倍，排序CAF的胞质CXCL12升高2.70倍。

CXCL12在体外促进B细胞和CD8⁺T细胞的免疫抑制表型

分离原代mPSC，通过α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫组化和油红O染色验证其身份，然后通过SV40大T抗原和端粒酶转染永生化。分离纯度超过90%的原代B细胞和CD8⁺T细胞，与转染阴性对照或CXCL12过表达质粒的mPSC共培养，加入肿瘤上清模拟肿瘤微环境，应用plerixafor（500 ng mL^-1）拮抗CXCL12-CXCR4轴。mPSC^oe-CXCL12共培养显著升高CD22⁺B细胞百分比，plerixafor处理逆转此过程；mPSC^oe-CXCL12组CD8⁺T细胞平均TIGIT强度增加6.55倍，plerixafor降低此效应。凋亡检测显示mPSC^oe-CXCL12共培养诱导CD8⁺T细胞凋亡事件增加2.37倍，plerixafor使凋亡率降低1.88倍。CFSE增殖实验表明CXCL12抑制CD8⁺T细胞增殖。B细胞表型分析发现糖尿病状态下白细胞介素-10（IL-10）和IL-35（B调节细胞（Breg）标志物）升高，mPSC^oe-CXCL12共培养诱导IL-10和IL-35增加，plerixafor抑制此效应。

CXCL12在体内加剧适应性免疫迁移和功能障碍

通过混合注射mPSC和Panc02细胞（比例1:4）建立皮下模型，mPSC转染阴性对照或CXCL12过表达质粒，静脉注射plerixafor阻断CXCL12-CXCR4轴。mPSC^oe-CXCL12组肿瘤体积显著大于mPSC^oe-NC组，plerixafor治疗减缓并逆转肿瘤侵袭性生长。免疫组化显示mPSC^oe-CXCL12组B细胞和CD8⁺T细胞分布增加，plerixafor抑制此现象。流式细胞术检测肿瘤组织单细胞悬液，发现mPSC^oe-CXCL12组CD22⁺CD19⁺B细胞和TIGIT⁺CD8⁺T细胞比例分别为mPSC^oe-NC组的6.46和2.66倍，plerixafor处理组分别降低3.19和2.09倍。

讨论

糖尿病与胰腺癌相互关联。本研究证实糖尿病PAAD中免疫重编程是关键机制。CXCL12作为CAF表达的关键因子，调控B细胞和CD8⁺T细胞的浸润和功能，诱导免疫抑制表型。Plerixafor拮抗CXCL12-CXCR4轴显示治疗潜力。研究局限性包括需构建原位PAAD基因工程小鼠模型验证，永生化PSC可能存在未知信号调控，临床样本量较小等。

结论

糖尿病胰腺癌中升高的CXCL12^HighCAF诱导功能失调的抗肿瘤 immunity，以CD22⁺B细胞和TIGIT⁺CD8⁺T细胞为特征。阻断CXCL12-CXCR4轴可逆转免疫抑制，为糖尿病相关胰腺癌免疫治疗提供新策略。