3D生物打印载有骨肉瘤球体的脱细胞基质增强模型：提升药物测试与治疗发现的创新平台

《Advanced Healthcare Materials》：A 3D Bioprinted Spheroid-Laden dECM-Enriched Osteosarcoma Model for Enhanced Drug Testing and Therapeutic Discovery

本综述系统阐述了基于3D生物打印技术构建的骨肉瘤（OS）仿生模型，通过整合OS球体与OS特异性脱细胞基质（dECM）增强型生物墨水，精准模拟肿瘤微环境（TME）的三维结构、细胞-细胞相互作用及细胞-基质交互，显著提升药物筛选（如多柔比星DOX）的临床预测性。模型通过上调P-糖蛋白（P-gp）表达、激活促生存通路（如PI3K/Akt）及保留关键ECM成分（如胶原COL1、纤连蛋白FIB），复现OS的化疗耐药特性，为开发个体化疗法提供新平台。

1 引言

骨肉瘤（OS）作为最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于儿童与青少年，其治疗策略自20世纪70年代以来进展有限，主要依赖甲氨蝶呤、多柔比星（DOX）和顺铂的MAP化疗方案联合手术切除。OS的高死亡率与转移性、异质性及化疗耐药密切相关，亟需能够准确模拟疾病特征的临床前模型。传统2D细胞模型和动物模型在重现肿瘤三维结构及细胞-ECM相互作用方面存在局限，而3D体外模型通过模拟肿瘤空间架构与微环境复杂性，为药物研发提供了更优平台。

2 结果

2.1 OS细胞来源dECM的表征

通过Triton X-100/氨水/DNAse I处理MG-63细胞，成功获得dECM，其DNA含量降至35.25 ng/mg（降低87%），符合脱细胞标准（<50 ng/mg）。免疫荧光显示胶原I（COL1）、纤连蛋白（FIB）及层粘连蛋白（LAM）在脱细胞后保留完整，糖胺聚糖（GAGs）与胶原含量分别增加1.04倍和2.26倍，证实dECM有效保留了ECM的生物活性成分。

2.2 OS仿生墨水的表征

研究开发了两种生物墨水：GMA（含5% GelMA、3% MC、1% ALG、0.1% LAP）与GMA-d（额外添加0.5% MG-63来源dECM）。两者均具高含水率（≈90%）、低质量损失（14天内<14%）及适宜压缩模量（≈7.3 kPa）。GMA-d墨水因dECM的引入略改善打印性能（打印因子Pr=0.93）与细胞活性（培养7天后存活率92.09%），且不影响墨水稳定性。

2.3 3D生物打印OS模型的构建

采用中密度（0.8×10⁶细胞/孔）培养3天的OS球体（直径197±13 μm）与GMA-d墨水结合，通过挤出式生物打印技术构建仿骨小梁结构的网格支架（10×10×1 mm）。打印后球体保持高活性（89.85–92.09%）与完整形态，部分相邻球体发生融合，模拟体内肿瘤聚集行为。

2.4 基于多柔比星的模型验证

与2D模型相比，3D生物打印模型对DOX（0.1–1 μg/mL）表现出显著耐药性：在1 μg/mL DOX处理下，2D细胞存活率降至15.24%，而3D打印模型仍保持63.1%。基因分析显示，生物打印模型中（6.95倍）、（11.30倍）及（3.23倍）表达显著上调。免疫组化证实模型组成性高表达P-gp（药物外排泵）并保留Caspase-3（Casp3）非凋亡功能，揭示了其通过激活促生存通路与物理屏障作用协同诱导耐药的机制。

3 讨论

该模型通过dECM提供OS特异性生化线索，结合球体与生物打印技术，实现了对TME结构、基因表达谱及药物应答的高度模拟。尽管墨水机械强度（≈7.3 kPa）低于体内OS硬度范围（1–50 kPa），但其在保留关键ECM成分、促进细胞相互作用方面的优势使其成为药物筛选的理想平台。未来可通过引入基质细胞、内皮细胞等进一步优化模型复杂性。

4 结论

本研究成功开发了一种新型3D生物打印OS模型，整合了球体培养与dECM增强支架的优势，在模拟OS化疗耐药性与分子特征方面优于传统模型，为个体化治疗策略开发提供了可靠工具。

5 实验方法

研究使用MG-63细胞进行球体培养与dECM制备，通过定量PCR、流式细胞术、免疫荧光等技术系统评估模型生物学特性。生物打印采用气压挤出系统，结合UV/ CaCl₂交联固化支架，所有实验均设三次生物学重复（N=3），数据以均值±标准差表示。