《Journal of Functional Foods》：A novel antitumor peptide from silkworm pupae (
Bombyx mori): Purification, characterization, and mechanism
编辑推荐：
本研究针对传统化疗药物毒性大、易产生耐药性等问题，从家蚕蛹蛋白酶解物中分离纯化出新型六肽YASPVH。研究发现该肽能通过诱导线粒体功能障碍（ROS积累、ΔΨm下降）和激活PERK/ATF4/CHOP内质网应激通路，诱导乳腺癌HCC-1937细胞G1期阻滞与凋亡，并显著抑制细胞迁移/侵袭能力。该食源性活性肽为乳腺癌治疗提供了低毒、高效的新候选策略。
在全球公共卫生领域，癌症始终是威胁人类健康的重大挑战。据世界卫生组织预测，到2040年全球新增癌症病例将达2950万，死亡病例将攀升至1640万。当前临床主要依靠手术、放疗和化疗等手段对抗癌症，其中化疗作为系统性治疗方式应用最为广泛。然而传统化疗药物如顺铂、紫杉醇等存在明显局限性——它们对癌细胞的靶向性差，在杀伤肿瘤细胞的同时会严重损伤正常组织，导致贫血、胃肠道黏膜炎、脱发及心脏毒性等不良反应。更严峻的是，长期化疗易引发肿瘤细胞的多药耐药现象，导致治疗效果大打折扣。因此，研发选择性高、毒性低且能克服耐药性的新型抗癌药物成为当务之急。
在这一背景下，从天然动植物资源中发掘生物活性肽成为研究热点。这些通常由5-50个氨基酸残基组成的小分子肽，凭借其分子量小、膜透性好的优势，在抗癌领域展现出独特潜力。与传统化疗药物相比，食源性活性肽具有系统毒性低、不易诱导耐药等显著优点，为开发高效低毒的抗癌药物提供了新思路。
家蚕作为具有五千多年驯化历史的经济昆虫，其蚕蛹富含优质蛋白质，干重中蛋白质含量高达55.6%。蚕蛹蛋白经酶解后产生的活性肽已被证实具有抗氧化、抗炎、抗高血压、免疫调节等多种生物活性，但其抗肿瘤作用机制仍有待深入探索。正是基于这一研究空白，江苏科技大学生物技术学院的研究团队在《Journal of Functional Foods》上发表了创新性研究成果，系统阐述了一种从家蚕蛹蛋白中分离的新型抗肿瘤肽YASPVH的作用机制。
为阐明YASPVH的抗癌机理，研究团队运用了多种关键技术方法。首先通过四种蛋白酶（木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶）水解家蚕蛹蛋白，并采用凝胶色谱层析结合LC-MS/MS技术成功分离鉴定出活性六肽Tyr-Ala-Ser-Pro-Val-His（YASPVH）。在功能验证方面，利用CCK-8法检测细胞活力，Hoechst 33342染色和Annexin V-FITC/PI双染观察细胞凋亡形态，流式细胞术分析细胞周期分布。机制探讨阶段采用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位，DCFH-DA染色测定活性氧水平，Western blotting分析关键蛋白表达，同时通过划痕实验和Transwell实验评估细胞迁移侵袭能力。
研究结果揭示了YASPVH的多重抗肿瘤机制：
3.1. SPPHs的抗增殖活性
四种酶解产物对六种癌细胞系均表现出显著抑制作用，其中木瓜蛋白酶水解产物（SPPH-P）对乳腺癌HCC-1937细胞的抑制效果最强，抑制率达65.22±2.86%（10 mg/mL），因此被选为后续活性肽分离的原料。
3.2. 抗肿瘤肽的纯化与表征
通过Sephadex G-100和G-15凝胶层析分离得到活性组分F3，经LC-MS/MS鉴定其氨基酸序列为Tyr-Ala-Ser-Pro-Val-His（YASPVH），分子量672.38 Da。该肽对HCC-1937细胞的IC50值为4.74±0.70 mg/mL，且对正常人脐静脉内皮细胞（HUVEC）毒性较低，显示出良好的安全性。
3.3. YASPVH对HCC-1937细胞形态的影响
显微镜观察显示，YASPVH处理后的细胞出现明显形态学改变：细胞皱缩、贴壁能力下降，与阳性对照药物紫杉醇引起的形态变化相似，表明该肽能有效诱导肿瘤细胞凋亡。
3.4. YASPVH对HCC-1937细胞凋亡和周期的影响
Hoechst 33342染色显示YASPVH处理组细胞核浓缩等典型凋亡特征。流式细胞术定量分析证实该肽以浓度依赖性方式诱导凋亡，10 mg/mL浓度下凋亡率达29.94±0.05%。细胞周期分析发现YASPVH引起G1期阻滞（对照组38.20% → 10 mg/mL组58.80%），Western blotting显示周期蛋白Cyclin D1和CDK6表达下调，从分子水平验证了G1期阻滞现象。
3.5. YASPVH对HCC-1937细胞的抗转移作用
划痕实验表明YASPVH显著抑制细胞迁移（对照组迁移率54.35% → 10 mg/mL组13.15%）。Transwell实验显示该肽有效降低细胞侵袭能力。分子机制上，YASPVH上调上皮标志物E-钙黏蛋白表达，下调间质标志物N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达，同时抑制基质金属蛋白酶MMP-2的表达，表明其通过抑制上皮间质转化（EMT）过程发挥抗转移作用。
3.6. YASPVH通过线粒体功能障碍通路诱导HCC-1937细胞凋亡
JC-1染色显示YASPVH引起线粒体膜电位（ΔΨm）显著下降，红绿荧光比值降低。DCFH-DA检测发现细胞内活性氧（ROS）水平急剧升高，而抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可逆转YASPVH引起的ROS积累和生长抑制。同时，YASPVH处理导致细胞内ATP含量大幅降低（10 mg/mL组降至对照组7.84±1.30%）。Western blotting结果显示促凋亡蛋白Bax、细胞色素c（Cyt-c）、caspase-3和剪切型PARP1表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降。Caspase-3活性检测进一步证实该肽能浓度依赖性激活caspase-3，而泛caspase抑制剂z-VAD-fmk可逆转这一效应。这些结果共同证明YASPVH通过诱导线粒体功能障碍激活内源性凋亡通路。
3.7. YASPVH通过内质网应激通路诱导HCC-1937细胞凋亡
Fluo-4 AM染色显示YASPVH引起细胞内Ca2+浓度升高，而内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）可拮抗这一效应。Western blotting分析发现YASPVH显著上调内质网应激关键蛋白PERK、p-PERK、p-eIF2α、ATF4和CHOP的表达，表明该肽通过激活PERK/ATF4/CHOP信号通路引发内质网应激相关性凋亡。
本研究系统阐明了家蚕蛹源肽YASPVH通过多重机制发挥抗肿瘤作用的分子基础。该肽不仅能通过线粒体通路和内质网应激通路诱导癌细胞凋亡，还能有效抑制细胞增殖、迁移和侵袭过程。特别值得关注的是，YASPVH对正常细胞毒性较低，且来源于可食用的蚕蛹蛋白，具有天然、安全的优势。这项研究不仅为乳腺癌治疗提供了新的候选分子，也为开发食源性抗肿瘤药物奠定了理论基础，在功能食品和医药领域具有广阔的应用前景。
