基于二甲苯酚橙的荧光/比色复合物的简单合成方法，可用于快速、灵敏且双模式检测炭疽生物标志物

《Microchemical Journal》：Simple synthesis of a xylenol orange–based fluorescent/colorimetric complex for rapid, sensitive and dual–mode detection of the anthrax biomarker

本研究开发了一种基于BSA/XO/Zn2+复合物的双模式检测方法，用于快速、灵敏检测炭疽杆菌芽孢的标志物DPA。通过竞争性结合机制，DPA同时与BSA和Zn2+相互作用，导致荧光淬灭和吸收红移，实现荧光/颜色双模式分析。该方法在真实样本中表现良好，并构建了可视化检测平台，为无铒检测提供了高效解决方案。

　　

余莉|韩静轩|李慧慧|于中林|王福香|郭东宇|黄勤坤|潘秦和

中国海南省海口市海南大学化学与化学工程学院，教育部热带岛屿资源先进材料重点实验室，邮编570228

摘要

在本研究中，利用二甲苯橙（XO）这种荧光/比色染料与牛血清白蛋白（BSA）和Zn²⁺容易形成复合物，从而实现对炭疽杆菌孢子（2,6-二吡啶酸，DPA）这一生物标志物的快速、灵敏的双模式检测。BSA/XO/Zn²⁺复合物在室温下通过BSA与XO的主客体化学作用以及XO与Zn²⁺的配位相互作用迅速生成。BSA和Zn²⁺协同作用引发了XO的红色发光，并使其吸收峰发生红移，同时在日光下颜色从黄色变为紫红色。当DPA加入BSA/XO/Zn²⁺体系后，会引发双重竞争效应：DPA通过与BSA的主客体结合及与Zn²⁺的配位作用取代XO，抑制了XO的红色发射并使其吸收峰蓝移，颜色从紫红色变为黄色。DPA与XO之间的双重竞争反应具有快速的动力学特性，荧光模式的检测限为34 nM，比色模式的检测限为298 nM。该复合物被应用于实际样品分析，并构建了一个可视化传感平台。这项研究提供了一种无需镧系元素的方法，用于高效检测致病性炭疽杆菌孢子，这对于相关安全事件的早期预警至关重要。

引言

炭疽杆菌孢子在孢子形成过程中会产生极耐受各种恶劣环境的微生物结构，能够抵抗高温、冷冻、干燥、紫外线辐射、高压、极端pH值和化学物质等杀菌压力[1]。即使炭疽杆菌细胞被杀死，炭疽杆菌孢子仍能在不利环境中保持休眠状态存活数十年甚至数千年[2]。一旦环境条件适宜，炭疽杆菌孢子会打破休眠状态，通过萌发过程转化为可繁殖的炭疽杆菌细胞，进而引发炭疽病[3]、[4]。历史上炭疽杆菌孢子曾被用作生物武器[5]。在生物袭击中，空气、水和食物的污染可能引发严重的公共卫生危机和环境问题[3]、[6]。因此，检测炭疽杆菌孢子对于相关安全事件的早期预警至关重要。

2,6-二吡啶酸（DPA）是炭疽杆菌孢子的关键成分，已被证实是炭疽杆菌孢子的重要生物标志物[7]。孢子最内层保护层中含有大量DPA，占其干重的5%–15%[8]。当孢子受到物理裂解、化学裂解或萌发时，DPA会被释放[9]。在基于DPA检测的众多方法中，荧光光谱法具有简单、快速、高灵敏度、优异选择性和可见光观测的优点[10]、[11]、[12]。如先前报道，镧系离子具有独特的发光特性，如长荧光寿命、窄的f–f发射带和较大的斯托克斯位移[13]、[14]、[15]。因此，基于镧系元素的材料（如镧系配位复合物、镧系金属有机框架、镧系共价有机框架和镧系离子修饰的碳点）已被广泛用于DPA的荧光检测[16]、[17]、[18]、[19]。这些材料的传感机制依赖于DPA与镧系离子的配位作用，从而影响其发光特性[20]。

然而，基于镧系元素的DPA荧光分析存在以下问题：（1）镧系元素的使用成本较高，且对环境有较大影响；（2）单模式荧光检测容易受到环境和仪器参数的影响，导致结果不准确；（3）材料制备过程复杂，耗时且耗能；（4）需要进一步提高检测的快速性和灵敏度。因此，迫切需要开发无需镧系元素、合成简单的传感材料，以实现基于荧光/比色双模式的DPA快速灵敏检测。

本文中，二甲苯橙（XO）作为荧光/比色染料与牛血清白蛋白（BSA）和Zn²⁺容易形成复合物，从而实现对DPA的快速、灵敏的双模式检测（图1）。XO是一种基于三苯甲烷的染料，具有金属离子的比色/荧光双模式指示特性，其特征是聚集诱导发光（AIE）[23]。蛋白质表面或内部通常存在可作为主客体相互作用位点的结构[24]、[25]、[26]、[27]。在此基础上，BSA/XO/Zn²⁺复合物在室温下通过BSA与XO的主客体化学作用以及XO与Zn²⁺的配位相互作用迅速生成。BSA的主客体化学作用和Zn²⁺的配位相互作用协同作用引发了XO的红色发光，并使其吸收峰发生红移，同时在日光下颜色从黄色变为紫红色。DPA通过与BSA和Zn²⁺的主客体及配位作用竞争性地相互作用，抑制了XO的红色发射并使其吸收峰蓝移，实现了DPA的荧光/比色双模式分析。DPA与XO之间的双重竞争反应具有快速的动力学特性和增强的灵敏度。

试剂和仪器

实验所用试剂和仪器详见支持信息。

复合物的合成

将XO（1 mM，60 μL）、BSA（2 mM，20 μL）和Zn²⁺（5 mM，20 μL）的水溶液加入HEPES缓冲液（pH 5，10 mM，3900 μL）中，在室温下迅速形成BSA/XO/Zn²⁺复合物。

DPA的双模式检测

将XO（1 mM，60 μL）、BSA（2 mM，20 μL）和Zn²⁺（5 mM，20 μL）的水溶液混合在HEPES缓冲液（pH 5，10 mM）中，

复合物的表征

研究了BSA与XO之间的主客体相互作用。BSA具有两个主要的结合位点：IIA亚域中的药物位点I（DS1）和IIA亚域中的药物位点II（DS2）（图S1）[28]、[29]。BSA与药物分子和有机染料的主客体相互作用已得到广泛研究[30]、[31]、[32]。监测了有无XO时BSA的圆二色光谱变化，结果发现XO的加入改变了BSA的圆二色光谱（图2）

结论

本研究开发了一种基于BSA/XO/Zn²⁺复合物的简单、快速、灵敏的荧光/比色双模式探针，用于检测炭疽杆菌孢子的生物标志物（DPA）。该研究提供了一种无需镧系元素的高效检测方法，对于相关安全事件的早期预警至关重要。然而，专为DPA检测设计的BSA/XO/Zn²⁺复合物为一次性使用，不可重复利用。

CRediT作者贡献声明

余莉：撰写初稿、实验研究、数据整理。韩静轩：实验研究。李慧慧：撰写、审稿与编辑、指导。于中林：实验研究。王福香：撰写、审稿与编辑、资金申请。郭东宇：撰写、审稿与编辑、指导。黄勤坤：实验研究。潘秦和：撰写、审稿与编辑、指导、资金申请。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

感谢国家自然科学基金（编号22361017）、海南省院士创新平台专项研究基金（编号YSPTZX202321）、海南省自然科学基金（编号524MS027）以及海南省院士创新平台的财政支持。