《Journal of Inherited Metabolic Disease》：Unveiling Immune System Perturbations in Early Development Through Zebrafish Models of NADHX Repair Deficiency
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本综述系统阐述了NAD(P)HX修复系统缺陷（涉及NAXE和NAXD基因）如何通过斑马鱼模型引发早期发育异常。研究发现naxd?/?突变体出现运动能力下降、早期死亡等严重表型，并首次证实免疫系统紊乱（如小胶质细胞激活、炎症因子上调）是疾病发展的关键机制。值得注意的是，烟酸（NA）治疗可部分挽救突变体表型，为临床干预提供了重要方向。该研究为理解PEBEL疾病（PEBEL1/PEBEL2）的免疫代谢基础提供了新视角。
引言：NAD(P)HX修复系统与PEBEL疾病
NADH和NADPH作为关键辅因子，在细胞内易发生水合反应形成无 redox 活性的羟基化衍生物NADHX和NADPHX。这些损伤代谢物由两种高度保守的酶修复：NAD(P)HX脱水酶（NAXD）和NAD(P)HX差向异构酶（NAXE）。人类NAXE或NAXD基因突变会导致早发性进行性脑病（PEBEL1或PEBEL2），临床特征包括发热诱发的神经发育倒退、癫痫发作等，超过70%患者会过早死亡。为解析疾病机制，研究团队通过CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼naxe和naxd缺陷模型。
斑马鱼Naxd和Naxe蛋白的进化保守性与表达特征
序列比对显示斑马鱼Naxd和Naxe蛋白与人类同源物具有高度保守性，关键功能域（如NAD(P)HX结合位点、ATP结合域）完全保留。酶活实验证实重组斑马鱼Naxd蛋白具有与人类NAXD相似的S-NADHX脱水酶活性。表达分析发现naxd和naxe基因在神经组织（脑、眼）中表达最高，与PEBEL疾病以神经系统症状为主的特征相符。
CRISPR/Cas9技术构建稳定突变系及功能验证
针对naxd和naxe基因第5外显子设计gRNA，获得naxd?/?（26 bp缺失）和naxe?/?（8 bp缺失）突变体。LC-MS检测显示naxd?/?幼虫中S-NADHX积累量是naxe?/?的8倍，且两种突变体均出现NAD+和NADH水平下降。值得注意的是，naxd?/?突变体无法存活至成年，而naxe?/?个体可正常发育繁殖，表明NAXD功能缺失的毒性更强。
Naxd缺陷导致斑马鱼早夭及运动异常
生存分析显示naxd?/?幼虫在13-14日龄时存活率骤降至50%，17日龄前全部死亡。行为学检测发现突变体在10日龄后游泳速度下降40%-80%，13日龄时体长和头长显著缩短。Western blot显示13日龄突变体线粒体复合体I（NDUFB8）和复合体V（ATP5A）亚基表达上调，提示存在氧化应激补偿机制。
Naxd?/?幼虫呈现免疫系统失调
中性红染色显示7日龄naxd?/?幼虫头部小胶质细胞数量/活性增加，qPCR检测发现炎症因子（il6、il1b、tnfb等）表达上调。10日龄时转录组分析揭示74个差异表达基因，其中干扰素通路相关基因（如irf1b、rsad2）显著下调，而应激反应基因（atf3、hspb9）上调。GO富集分析表明"病原体反应"通路受影响最显著，提示先天免疫防御机制受损。
烟酸治疗改善naxd?/?幼虫表型
100 μM烟酸（NA）处理使naxd?/?幼虫存活期延长至27日龄，10日龄和13日龄时的运动能力完全恢复。LC-MS检测发现治疗组NAD+和NADH水平显著提升，但S-NADHX和R-NADHX也同步积累。这一矛盾现象提示烟酸通过补充正常辅因子暂时缓解症状，但长期可能加剧损伤代谢物毒性。
Naxe?/?幼虫的隐性免疫异常
尽管naxe?/?幼虫无显著表型，5日龄头部转录组显示免疫相关基因下调，中性红染色同样发现小胶质细胞增多。LPS刺激实验表明突变体炎症因子诱导能力缺失，证明NAXE缺陷会导致免疫应答迟钝。这种"静默型"免疫失调可能与人类PEBEL1疾病需外界触发才发病的特点相符。
讨论：免疫代谢视角下的PEBEL疾病机制
本研究首次在体证实NAD(P)HX修复缺陷与免疫系统发育的关联。naxd?/?模型呈现的小胶质细胞异常活化、细胞因子风暴及干扰素信号抑制，与线粒体疾病中免疫细胞驱动神经病理的现象相呼应。值得注意的是，斑马鱼饲养温度（28℃）低于哺乳动物体温，可能部分解释naxe?/?模型表型较温和的原因。烟酸治疗的时效性提醒临床需警惕长期大剂量维生素B3治疗的潜在风险。这些斑马鱼模型为揭示PEBEL疾病的免疫代谢机制提供了重要平台。
