弯管离心驱动微滴法高效富集与培养肠道低丰度微生物新策略

《MicrobiologyOpen》：Harnessing the Gut Microbes of Low Abundance With a Bent-Capillary-Centrifugal-Driven (BCCD) Microdroplet Method

本研究创新性地采用弯管离心驱动（BCCD）微滴培养技术，突破传统平板培养对肠道低丰度微生物（相对丰度<0.1%）的分离瓶颈。该方法通过将粪便微生物随机封装于50 nL微滴中，显著提升低丰度菌群富集效率，成功分离出1049株细菌（涵盖123个物种、58个属），包括8个新物种。研究证实BCCD培养可重塑菌群结构，降低时间波动性（p<0.05），为挖掘未培养肠道微生物资源提供关键技术支撑。

　　

1 引言

肠道微生物对宿主健康与疾病的作用日益受到关注，但其可培养性仍是研究微生物-宿主互作的关键限制因素。传统培养方法（如平板法）难以捕获低丰度微生物（<0.1%），而现有微流控单细胞分离技术虽能高通量分选，却因过度物理隔离限制了依赖群体感应或交叉喂养的微生物生长。本研究基于弯管离心驱动（BCCD）微滴生成器，将粪便菌群分散至约50 nL的微滴中进行预培养，通过空间分隔降低优势菌群的竞争压力，为低丰度微生物创造增殖条件。

2 材料与方法

研究采集健康志愿者新鲜粪便样本，在厌氧条件下用改性Gifu厌氧培养基（mGAM）等稀释后，通过BCCD装置将25 μL样本分散至含油相的48孔板中形成微滴，并与平板培养法对比。培养5-10天后，收集微生物进行16S rRNA测序（靶向V3-V4区），使用QIIME2和SILVA数据库进行群落分析。分离菌株通过全长16S rRNA测序和基因组分析（ANI<95%、dDDH<70%为novel species标准）鉴定新物种。

3 结果

3.1 微滴封装与培养效果

BCCD方法成功将粪便菌群封装于均匀微滴（图1B），随机分布微生物细胞。与平板法相比，BCCD培养显著改变菌群结构，且时间波动性更低（p<0.05）。

3.2 低丰度微生物富集能力

BCCD将粪便样本中低丰度菌群总相对丰度从9.8%提升至78.3%，平板法为76.5%。LEfSe分析显示BCCD特异性富集29个低丰度属（如双歧杆菌属^{Bifidobacterium}、克里斯滕森菌属^{Christensenella}），平板法则富集26个属（如多尔氏菌属^Dorea）。

3.3 菌株分离与多样性

通过14种预处理结合BCCD培养，共分离1049株菌，涵盖123个物种、58个属，其中62.1%属低丰度菌群。与HBC、SPORE等四大肠道微生物库对比，本研究独有45个物种（图3B），包括8个新物种（如球形拟杆菌^{Bacteroides sphaericus}、华佗布劳特氏菌^{Blautia huatuoi}）。

3.4 新物种表征

8个新物种通过系统发育分析、基因组（GC含量41.1%-50.4%）和形态学（透射电镜观察）多相分类鉴定，均符合国际原核生物命名规则（表1），菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）。

4 讨论

BCCD微滴培养通过物理分隔与随机封装策略，有效促进低丰度及互作依赖型微生物生长，但该方法仍受优势菌群干扰且需多培养基优化。未来可结合代谢模型预测，进一步提升难培养菌（如UCG群）的分离效率。

5 结论

BCCD微滴培养技术为肠道低丰度微生物的资源挖掘和功能研究提供了高效互补工具，推动未培养微生物的探索进程。