《The Ocular Surface》：Comprehensive Profiling of the Human Tear Fluid miRNome Using Small RNA Sequencing
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本研究通过新一代测序技术系统解析健康人眼泪液中miRNA表达谱，建立首个高分辨率眼泪miRNA参考数据库，揭示其与转录调控、细胞骨架组织等通路的关联，为眼部疾病生物标志物开发提供重要基准。研究证实检测方法具有高度可重复性，并发现部分miRNA存在种族差异性表达，为眼泪诊断学奠定基础。
当我们因感动而落泪时，眼泪不仅是情感的载体，更是一扇洞察健康的窗口。眼泪液作为直接接触眼球表面的生物流体，富含蛋白质、脂质和核酸等生物分子，能够灵敏反映眼部局部病理变化。近年来，微RNA（microRNA, miRNA）——一类长约22个核苷酸的非编码RNA分子——因其在基因转录后调控中的关键作用及在体液中的稳定性，已成为疾病诊断标志物的研究热点。然而，与血液、唾液等体液相比，眼泪液中miRNA的系统性研究仍处于起步阶段，这限制了我们对其在眼部健康与疾病中调控机制的理解，也阻碍了眼泪衍生诊断标志物的开发。
为填补这一空白，来自奥古斯塔大学的研究团队在《The Ocular Surface》上发表了题为"Comprehensive Profiling of the Human Tear Fluid miRNome Using Small RNA Sequencing"的研究。该研究采用优化的小RNA测序流程，对32名健康成年人的眼泪液样本进行深度分析，首次构建了高质量的人眼泪液miRNA参考图谱，并探索了miRNA表达与性别、种族、年龄等因素的关联，为后续基于眼泪的生物标志物研究奠定了坚实基础。
研究人员采用了几项关键技术：首先使用Schirmer试纸无创采集志愿者眼泪样本，通过miRNeasy Serum/Plasma Kit提取RNA；接着利用QIAseq miRNA Library Kit构建cDNA文库，在NovaSeq 6000平台上进行高通量测序；生物信息学分析包括使用Cutadapt去除接头序列，Bowtie1比对miRBase数据库，DESeq2进行标准化处理，并通过multiMiR和clusterProfiler进行功能注释。差异表达分析采用负二项固定效应模型，同时纳入性别、年龄、种族和批次作为协变量。
3.1. 人眼泪液的本构miRNA组
研究共鉴定出318个在眼泪液中稳定表达的miRNA，其中246个在所有个体中均被检测到。表达量最高的miRNA包括hsa-let-7a-5p、hsa-let-7f-5p等let-7家族成员。这些高丰度miRNA主要参与细胞周期调控、免疫信号传导和上皮维持等过程。
3.2. 眼泪液中的主要miRNA家族
分析显示let-7家族（13个成员）表达最为丰富且稳定，其次为miR-30（10个成员）、miR-8（10个成员）等家族。这些家族在上皮完整性、免疫调节和应激反应中发挥重要作用，与眼表生理功能高度相关。
3.3. 批次效应分析
相隔六个月处理的两个批次样本表现出高度一致性（R2≈0.99），证明实验流程具有优异的可重复性。聚类分析显示样本未按批次分离，表明批次效应极小。
3.4. 眼泪液miRNA靶标的生物学过程富集
Gene Ontology分析显示，miRNA靶基因显著富集于轴突生成、神经元发育、上皮管形态发生等过程，表明眼泪miRNA参与眼表神经传感和上皮结构的调控。
3.5. 眼泪液miRNA靶标的KEGG通路富集
KEGG通路分析发现IgSF细胞黏附分子、MAPK信号通路、轴突导向等通路显著富集，提示眼泪miRNA参与细胞通讯、细胞内信号传导和上皮结构调节。
3.6. 眼泪液miRNA在性别和种族中的差异表达
种族比较发现hsa-miR-375-3p和hsa-miR-708-5p在白人个体中表达显著升高，而hsa-miR-106b-3p在女性中呈现非显著性上升趋势。年龄相关差异未达统计学显著性。
3.7. 稳定的眼泪miRNA
通过变异系数、geNorm和NormFinder综合评估，鉴定出hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-16-5p等10个表达最稳定的miRNA，可作为未来眼泪miRNA研究的内参基因。
这项研究通过建立首个全面的人眼泪液miRNA参考图谱，揭示了其与眼表稳态维持相关的核心调控网络。研究发现眼泪miRNA组成稳定且重现性高，主要富集于上皮屏障维护、细胞内信号传导和神经传感调节等通路。尽管样本量限制了对人口学因素影响的深入探索，但鉴定出的稳定内参基因为后续研究提供重要工具。该工作为开发干眼症、青光眼等眼病及神经退行性疾病的眼泪诊断标志物奠定基础，推动眼泪液成为非侵入性分子诊断的重要来源。
