《Nature Chemical Biology》：Functional analysis of O-GlcNAcylation by networking of OGT interactors and substrates
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本综述提出NOTISE系统方法，通过整合OGT互作蛋白与底物网络，揭示O-GlcNAc修饰在细胞活动协同调控中的核心作用，为糖尿病、癌症等疾病机制研究提供新视角（PTM：翻译后修饰；OGT：O-GlcNAc转移酶）。
O-GlcNAc糖基化的功能网络分析
近年来，蛋白质O-连接β-N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）修饰的功能研究多聚焦于单个修饰事件。本研究开发的NOTISE（Networking of OGT Interactors and Substrates）方法，通过系统水平整合O-GlcNAc转移酶（OGT）的相互作用蛋白与底物网络，首次实现了O-GlcNAc修饰在蛋白质组中的快速全面监测，揭示了其协同调控细胞活动的分子基础。
OGT相互作用蛋白的鉴定
研究团队通过串联亲和纯化-质谱联用技术（TAP-MS）结合稳定同位素标记（SILAC），在HEK293T细胞中鉴定出519个高置信度OGT相互作用蛋白。实验采用可诱导表达双标签OGT-FH（FLAG-HA）的细胞系，通过多轮免疫共沉淀富集OGT复合物（图1a）。Western blot验证显示，已知互作蛋白如RBBP5、NUP62等均被有效捕获（图2b）。统计分析表明，96%的互作蛋白在三次重复实验中均被检出，且62%为此前未被报道的新互作因子（图2c-d）。
O-GlcNAc修饰位点的全局图谱绘制
团队进一步发展了基于化学酶标记（CL）的O-GlcNAc位点鉴定技术。采用新型可切割生物素标签（化合物1，图2e），通过点击化学与质谱联用，实现了糖肽的高效富集与精准定位。结合HCD触发ETD/EThcD的多级碎裂策略（图2f），在HEK293T细胞中共鉴定到1,764个非冗余O-GlcNAc修饰事件（涉及646个蛋白），其中绝大多数位点可定位至特定丝氨酸/苏氨酸残基（图2g）。例如，在HCFC1蛋白上发现72个修饰位点，其中6个为首次报道（图2h）。序列分析显示，O-GlcNAc修饰周边序列无显著保守性，但存在脯氨酸偏好性（图2i-j）。
功能化O-GlcNAc网络的构建与解析
通过将OGT互作组与O-GlcNAc修饰组数据整合，并基于BioGRID、IntAct等数据库的蛋白质相互作用信息，构建了全局O-GlcNAc功能网络（图3a）。利用GLay算法将网络划分为10个高度互联的功能群落，其中5个主要群落分别富集于转录后调控、染色质组织与重塑、核质运输与细胞骨架组织、RNA/DNA合成与降解、mRNA剪接与翻译起始等生物学过程（图3a-c）。功能聚类分析表明，O-GlcNAc修饰通过调控组蛋白修饰复合物（如SET1/COMPASS、MLL、PR-DUB、NSL复合物）核心组分，广泛参与表观遗传调控（图3c）。此外，在聚类5中发现O-GlcNAc修饰深度参与RNA剪接调控，涉及剪接因子SRSF家族、U1 snRNP组分SNRPA及剪接体催化核心Prp19复合物等（图5a-c）。
PTM交叉对话与网络枢纽蛋白的功能验证
通过整合PhosphoSitePlus数据库，发现约25%的O-GlcNAc位点与磷酸化位点直接重叠，65%位于其他PTM位点10个氨基酸范围内（图4a）。以STAT3蛋白为例，其T717位O-GlcNAc修饰可抑制邻近磷酸化位点（如S727）的活性，体现了PTM交叉对话的精细调控（图4b）。进一步分析发现，BAP1等OGT互作蛋白可能作为“枢纽”分子，引导OGT对特定底物（如FOXK1、ASXL3）进行位点特异性修饰（图4c-f）。通过CRISPR-Cas9敲除BAP1的实验证实，其缺失可选择性影响邻近底物的O-GlcNAc修饰水平，而不干扰SET1/COMPASS等复合物的OGT活性（图4g-j）。
体内O-GlcNAc网络的组织特异性解析
研究还构建了OGT-FH基因敲入小鼠模型（图5a），验证了标签蛋白在脑、肝等组织中的表达与内源OGT相当（图5b）。通过iNOTISE（in vivo NOTISE）分析，在小鼠脑和肝脏中分别鉴定出993个/643个OGT互作蛋白及2,219个/1,150个O-GlcNAc修饰事件（图5c-d）。网络聚类显示，O-GlcNAc修饰在脑中富集于突触可塑性、神经元发育等功能，而在肝脏中主要参与脂代谢、ATP合成等过程（图5e-h）。组织间对比表明，修饰底物重叠率（39.2%）与蛋白质组重叠率（50.8%）接近，但互作蛋白重叠率仅27.7%，提示OGT通过组织特异性互作蛋白实现功能分化（图5i）。
神经元中O-GlcNAc调控机制的案例研究
在皮层神经元中，研究发现兴奋性刺激可动态调控Ppfia1等突触支架蛋白的O-GlcNAc修饰（图6f-h）。该修饰位于Ppfia1 C端保守区域（图6i），与GRIP1 PDZ6结构域结合界面重叠（图6j），可能通过影响AMPAR簇聚调控突触功能。这些结果揭示了O-GlcNAc修饰在神经系统中调控突触结构与可塑性的新机制。
综上，NOTISE技术为系统性解析O-GlcNAc修饰的功能网络提供了强大平台，揭示了其在细胞功能协同调控中的核心地位，为相关疾病治疗策略开发提供了新思路。
