双金属纳米酶/聚吡咯/亚甲蓝平台：光热与催化协同破坏生物膜并促进血管生成用于糖尿病伤口愈合

《Small Science》：Bimetallic Nanozymes/Polypyrrole/Methylene Blue Platform for Photothermal and Catalytic Biofilm Disruption and Angiogenesis Enhancement in Diabetic Wound Healing

本文推荐了一种新型双金属杂化纳米花（CeZn@PPY@MB NFs），其整合了氧化铈-氧化锌纳米酶、聚吡咯（PPY）光热涂层和亚甲蓝（MB）光敏剂，通过近红外（NIR）激光触发协同光热疗法（PTT）、光动力疗法（PDT）和多酶催化活性，有效清除耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）生物膜、调节活性氧（ROS）水平、减轻炎症并促进组织再生与血管生成，为耐药细菌感染的糖尿病足溃疡提供了前景广阔的抗生素替代治疗方案。

　　

引言

糖尿病伤口由于组织再生受损、炎症 prolonged、氧气供应不足和微生物感染而构成重大挑战。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染通过延长炎症和增加抗菌素耐药性来延迟愈合。为了开发有效的抗生素替代品，研究人员开发了多功能纳米复合材料——负载亚甲蓝（MB）的聚吡咯（PPY）涂层氧化铈-锌纳米花（CeZn@PPY@MB NFs），以满足糖尿病伤口愈合的多方面需求。

结果与讨论

2.1 氧化铈-锌纳米花的制备与表征

设计了一种由双金属（氧化铈和锌）纳米花组成的新型纳米复合材料，该纳米花涂覆有光热剂PPY，并负载光敏剂MB。这种设计旨在同时改善光热加速、催化调节的抗菌、抗炎和修复能力，以有效治愈MRSA感染的糖尿病伤口。表征结果显示，CeZn@1.8PPY@MB NFs 具有合适的粒径（234.2±1.69 nm）、Zeta电位（32.2±0.31 mV）和MB负载量（7.86±0.11%）。扫描电子显微镜（SEM）和扫描透射电子显微镜（STEM）分析显示，纳米花呈现出类似水百合花的形态，具有花瓣状结构，从核心径向辐射，这有助于有效的光热治疗和更大的治疗剂负载。能量色散X射线光谱（EDX）和元素映射证实了Ce、Zn、O、C和N元素的均匀分布，表明涂层和负载技术成功。X射线光电子能谱（XPS）分析进一步证实了PPY涂层的存在以及Ce³⁺/Ce⁴⁺和Zn²⁺的价态。X射线衍射（XRD）图谱显示了氧化铈和氧化锌的晶体结构，而PPY涂层和MB负载则呈现出无定形特征。傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示了与氧化物拉伸、O-H键以及吡咯环振动相关的特征吸收峰，证实了CeZn@PPY@MB NFs的成功合成。

2.2 氧化铈-锌纳米花的光热性能

通过水热法合成的双金属杂化氧化铈-锌纳米花，在涂覆聚吡咯（PPY）后，表现出在近红外（NIR）照射下优异的光热转换效率。PPY的共轭聚合物主链使其能够吸收NIR光（808 nm）并将光能转化为热能。负载的MB作为光敏剂，在光热效应的协同下，可以增强其光动力作用。紫外-可见光谱显示CeZn@PPY@MB纳米花在NIR区域有良好的吸光度。红外热成像评估表明，纳米花表现出浓度依赖性和辐照强度依赖性的光热性能。浓度为100 μg mL^-1的纳米花分散液在1 W cm^-2的808 nm激光照射5分钟后，最高温度可达55°C。通过开关脉冲实验证实了其良好的光热稳定性，经过六个循环后仍能保持稳定的升温能力。计算得出其光热转换效率（η）高达61.492%，表明该纳米复合材料具有高效的光热治疗潜力。

2.3 氧化铈-锌纳米花的协同多酶活性

合成的PPY涂层MB负载双金属杂化氧化铈-锌纳米花表现出多种酶样功能，其活性受pH值和NIR照射的影响。在较低pH值下，纳米花模拟过氧化物酶（POD）和氧化酶（OXD）活性，能够催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）底物氧化并产生羟基自由基（·OH），对细菌细胞造成损伤。酶动力学分析显示，CeZn@PPY@MB NFs 具有最大的最大反应速率（V_max= 4.731 μM min^-1）和最小的米氏常数（K_m= 0.112 mM），表明其对底物有高亲和力和催化效率。在NIR激光照射下，纳米花的过氧化氢酶（CAT）样和超氧化物歧化酶（SOD）样活性也得到增强。CeZn@PPY@MB NFs 表现出最强的CAT样活性，能有效分解H₂O₂产生氧气，并在5分钟后达到稳定状态。同时，它也表现出强大的SOD样活性，能够清除超氧阴离子自由基（O₂^•-），并具有显著的羟基自由基清除能力。这些多酶活性是pH响应性的：POD样活性在酸性条件下优化，有利于感染早期的细菌清除；而CAT和SOD样活性在中性至碱性pH下表现最佳，有助于愈合后期的氧化应激减轻和组织修复。这种阶段特异性的酶模拟活性使纳米花能够根据伤口阶段的pH动态调节ROS水平，实现协同的抗菌、抗炎和促愈合作用。

2.4 氧化铈-锌纳米花的抗菌和抗生物膜功效

糖尿病伤口常常伴有顽固的细菌生物膜感染。CeZn@PPY@MB NFs 通过其协同的光热-光动力-催化作用，对金黄色葡萄球菌（SA）和MRSA表现出强大的抗菌和抗生物膜功效。最低抑菌浓度（MIC）测定表明，在NIR激光照射下，CeZn@PPY@MB NFs 对SA和MRSA的MIC值显著降低至16和32 μg mL^-1。菌落计数实验显示，经NIR照射的CeZn@PPY@MB NFs 处理后，MRSA和SA的存活率分别降至2.43±0.17%和0.19±0.42%。纳米花处理还能显著抑制MRSA金黄色素（Staphyloxanthin）的生物合成，降低了细菌的毒力。通过DCFH-DA荧光探针检测发现，CeZn@PPY@MB NFs 结合NIR照射能显著增加细菌细胞内ROS水平，同时耗竭细胞内谷胱甘肽（GSH），导致细菌氧化损伤。抑菌圈实验也证实了其强大的抗菌能力。此外，纳米花处理能破坏细菌膜电位，导致细胞内蛋白质泄漏，进一步证实了其膜损伤机制。活/死细菌染色和流式细胞术分析表明，经CeZn@PPY@MB NFs 和NIR处理的MRSA和SA浮游细菌及生物膜中，死菌比例显著升高（MRSA死亡率达85.20±3.34%）。对于生物膜，纳米花能有效抑制胞外聚合物（EPS）的表达和生物膜生物量的形成。结晶紫染色和SEM观察显示，CeZn@PPY@MB NFs 能显著破坏生物膜结构，减少生物膜质量。其抗生物膜机制涉及光热效应破坏EPS基质、ROS损伤细菌成分、以及可能干扰群体感应系统。

2.5 氧化铈-锌纳米花的体外生物活性和血液相容性

在糖尿病伤口愈合中，高ROS和缺氧环境不利于皮肤细胞存活。CeZn@PPY@MB NFs 的组分旨在改善这一微环境。MTT法和划痕实验表明，CeZn@PPY@MB NFs 在NIR照射下能显著促进NIH-3T3小鼠成纤维细胞的增殖和迁移，迁移率高达96.34±0.69%。其促增殖作用源于氧化铈的抗氧化特性、锌的促有丝分裂作用、PPY光热效应诱导的促血管生成因子上调以及MB在可控ROS下对愈合反应的促进。鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）实验显示，CeZn@PPY@MB NFs 在NIR照射下能显著促进新血管生成，8小时后新生血管数量增加了约3.34倍。血液相容性实验表明，即使在高浓度下（高达1024 μg mL^-1），CeZn@PPY@MB NFs 引起的溶血率也低于5%，表明其具有良好的血液相容性。细胞毒性实验证实，纳米花在MIC浓度下对正常成纤维细胞无明显毒性，甚至能促进细胞增殖。

2.6 氧化铈-锌纳米花改善体内糖尿病伤口愈合

在糖尿病大鼠伤口模型中，评估了NIR响应的CeZn@PPY@MB NFs 的治疗效果。体内光热成像显示，局部应用纳米花并接受808 nm NIR激光照射后，伤口区域温度在5分钟内升高至约55°C。伤口愈合过程观察发现，经CeZn@PPY@MB NFs 和NIR治疗的组别，伤口闭合速度显著快于其他组别。在第14天，该治疗组的伤口闭合率达到98.86±0.089%，而糖尿病对照组仅为50.40±2.58%。伤口组织匀浆菌落计数显示，CeZn@PPY@MB NFs 加NIR治疗组的细菌负载量最低（5.33±2.08 CFU mL^-1），表明其强大的体内抗菌效能。组织学分析（H&E和Masson染色）显示，治疗组伤口组织有增强的新血管形成、加速的上皮再生、减少的炎症细胞浸润以及显著的胶原沉积（86.97%）。免疫荧光染色表明，治疗组伤口组织中的ROS水平（通过DCF荧光检测）显著降低，同时组织谷胱甘肽水平升高，反映了其抗氧化能力。促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α）的表达在治疗组显著下调，而细胞表面糖蛋白CD44和细胞增殖标志物Ki-67的表达则显著上调，表明炎症减轻和组织再生增强。这些效果归因于纳米花协同的光热、光动力和催化功能，包括有效的病原体清除、ROS调节、氧化应激缓解和促血管生成信号通路的激活。体内生化参数和主要器官的组织学分析未发现明显毒性迹象，证实了纳米花的良好生物相容性。

结论

本研究成功开发了一种新型的聚吡咯涂层、亚甲蓝负载的氧化铈-锌纳米花复合材料（CeZn@PPY@MB NFs），用于糖尿病伤口治疗，特别是针对MRSA感染。该复合材料具有独特的水百合花状形态，提供了高比表面积。其PPY涂层赋予优异的光热性能，MB负载则增强了光动力效应。该复合材料展现出良好的血液相容性和生物相容性。其核心优势在于协同的多酶模拟活性（POD、CAT、OXD、SOD）、NIR触发的光热/光动力效应以及pH响应性的ROS调节能力。体外和体内实验证实，该平台能有效杀灭MRSA、破坏生物膜、缓解炎症、促进细胞增殖、血管生成和组织修复，显著加速糖尿病伤口的愈合过程。因此，CeZn@PPY@MB NFs 作为一个多功能的纳米治疗平台，为管理耐药细菌感染的糖尿病足溃疡提供了一种有前景的抗生素替代策略。

实验部分

（此部分详细描述了材料的合成、各种表征方法、抗菌抗生物膜实验、细胞实验、体内动物实验的具体步骤、试剂和仪器条件，以及所使用的统计分析方法，为研究的可重复性提供了坚实依据。）