《npj Biological Timing and Sleep》：Glucocorticoid-dependence and independence of the circadian liver transcriptome
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本研究针对糖皮质激素（GC）信号在肝脏昼夜节律基因表达调控中的作用展开深入探索。研究人员通过整合分析GR ChIP-seq、核心时钟转录因子结合数据及肝脏昼夜节序RNA-seq数据，并结合肝细胞特异性GR敲除（GR-LKO）小鼠模型，系统评估了GR对肝脏昼夜节律转录组的贡献。研究结果揭示，尽管GR在大量节律基因的启动子和增强子处广泛结合，且与核心时钟转录因子结合存在共现现象，但肝细胞GR的缺失仅导致一小部分转录本节律性丧失或获得，大多数节律基因的表达模式保持不变。这表明GR对于维持大部分肝脏昼夜节律转录组的正常节律振荡并非必需，其传递节律信息的作用存在冗余性。该发现对于理解生理及病理条件下（如糖皮质激素治疗时机不当）肝脏代谢的昼夜节律调控具有重要意义。
生命体内部存在着精密的计时系统——生物钟，它如同一位无形的指挥家， orchestrating 着机体生理、代谢和行为近乎24小时的周期性波动。肝脏作为核心代谢器官，其基因表达、蛋白丰度和代谢通路活性均呈现出显著的昼夜变化。这种节律性不仅由肝细胞自身的分子钟驱动，也受到来自中枢时钟和全身性因素（如激素、进食时间）的深刻影响。其中，具有强昼夜振荡的糖皮质激素（Glucocorticoids, GCs）及其受体（Glucocorticoid Receptor, GR, NR3C1）被认为是连接系统信号与外周组织节律的关键桥梁之一。既往研究提示GR与核心时钟转录因子（如CLOCK、CRY、REV-ERBα）存在功能互作，且GCs能重置外周生物钟。然而，在生理条件下，内源性GCs/GR信号在多大程度上直接塑造了肝脏昼夜节律转录组的全景，其作用是主导性的还是辅助性的，仍存在争议。阐明此问题，对于理解轮班工作、睡眠障碍或不当用药时间等导致的昼夜节律紊乱如何通过GC信号通路影响肝脏代谢健康至关重要。
为回答上述问题，研究人员开展了一项综合性研究。他们首先利用已发表的基因组学数据进行深入的生物信息学分析，探究GR与核心时钟转录因子在基因调控区域的结合模式及其与基因节律性表达的关系。随后，他们通过在成年小鼠中诱导性、特异性敲除肝细胞中的GR基因（GR-LKO模型），并在严格昼夜自由运行（constant darkness, DD）条件下，高频采集肝脏组织进行RNA测序，直接评估GR缺失对肝脏转录组昼夜节律性的影响。相关研究成果已发表在《npj Biological Timing and Sleep》期刊上。
研究者为开展本项研究，主要应用了以下几项关键技术方法：1) 染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq），用于分析GR及多种核心时钟转录因子（如BMAL1, CLOCK, CRY1/2, PER1/2, NPAS2, REV-ERBα）和组蛋白修饰（H3K4me1, H3K27ac）在肝脏基因组上的结合分布；2) RNA测序（RNA-seq），对野生型（WT）和肝细胞GR敲除（GR-LKO）小鼠在48小时内每隔2小时采集的肝脏样本进行转录组分析，以评估基因表达的昼夜节律变化；3) 条件性基因敲除技术，通过他莫昔芬诱导的Alb-CreERT2系统在成年小鼠肝细胞中特异性删除GR基因；4) 生物信息学分析流程，包括使用compareRhythms、JTK-cycle等算法进行节律性分析和差异比较，以及Peaks to Genes (PEGS)、 motif 富集、上游调控因子分析等。
GR与时钟转录因子结合在基因启动子处共现
研究人员首先分析了GR与核心时钟转录因子在基因启动子区域的结合情况。整合肝脏GR ChIP-seq数据（来自地塞米松或溶剂处理的小鼠）与已发表的时钟因子ChIP-seq数据发现，在GR结合的启动子处，核心时钟转录因子（尤其是CRY1/2和PER1/2）的结合信号更强。此外，GR结合的启动子所关联的基因倾向于具有更高的表达水平。
GR启动子结合与更高的基因表达及节律性检测可能性相关
将肝脏昼夜节律RNA-seq数据中的基因按是否具有节律性（JTK cycle调整后p值<0.05）进行分类后，发现大多数（63%）节律基因的启动子有GR结合。有趣的是，GR结合的节律基因与非GR结合的节律基因在表达峰值相位分布上存在差异，前者峰值更集中于CT0附近，而后者呈现双峰（CT0, CT6）分布，这与内源性GCs（皮质酮）的峰值相位（CT8-12）并不一致。聚类分析和逻辑回归模型均证实，即使在校正了基因表达水平的影响后，GR启动子结合仍与基因节律性检测几率的增加显著相关。
GR结合于与节律基因相关的增强子
研究还将分析扩展至增强子区域。通过H3K4me1 ChIP-seq数据定义潜在增强子，发现GR结合的增强子比非GR结合的增强子距离转录起始位点（TSS）更远。在GR结合的增强子区域，同样观察到核心时钟转录因子结合和活性染色质标记H3K27ac信号的增强。大多数节律基因（58%）与GR结合的增强子相关联。然而，在控制了染色质开放度（使用DNase-seq数据）后，GR结合增强子处时钟因子结合的增强效应消失，提示这种共现可能主要源于开放的染色质环境。
成年期肝细胞GR缺失重塑肝脏转录组
通过比较GR-LKO与WT小鼠的肝脏转录组，鉴定出403个差异表达基因（197个上调，206个下调）。Peaks to Genes (PEGS) 分析显示，表达下调的基因显著富集于GR结合位点，而上调基因与GR结合关联较弱。
肝细胞GR缺失对节律性肝脏转录组影响有限
关键的节律性分析表明，在GR-LKO条件下，绝大多数基因的节律性未发生改变（10,773个基因在两个基因型中均无节律，4,370个基因节律相同）。仅有少量基因表现出节律性丧失（330个）、获得（349个）或改变（26个）。核心时钟基因（如Bmal1, Per1/2）在GR缺失后仍保持振荡，仅振幅有微小变化。对节律性发生改变的基因进行分析发现，节律丧失的基因其峰值相位分布较广，而上游调控因子分析提示STAT1/STAT5A可能参与了GR缺失后新出现的节律性。
肝细胞GR仅对一小部分昼夜节律转录组的节律性必不可少
对GR依赖性节律基因的深入分析表明，节律丧失的基因显著富集于GR结合位点，提示GR对其节律性有直接调控作用。然而，在节律性未发生改变的基因中也观察到GR结合的富集，表明GR结合对于大量节律基因而言是冗余的。上游调控因子分析进一步揭示了HNF4A、MLXIPL（ChREBP）等转录因子在维持节律性中的潜在重要作用。
本研究通过系统的生物信息学分析和严谨的体内基因功能验证，揭示了GR在肝脏昼夜节律转录组调控中作用的双重性：一方面，GR确实与大量节律基因的调控区域结合，并与时钟因子协同作用；另一方面，肝细胞GR的缺失仅对一小部分转录本的节律性产生显著影响。这表明，在完整的生物体内，肝脏基因表达的昼夜节律性具有强大的稳健性，GR信号并非其主要的或不可替代的节律驱动因素。内源性GCs/GR信号可能更多地在稳定生物钟、使其抵抗环境扰动方面发挥作用，而非直接传递核心的时序信息。这一发现挑战了GR是肝脏昼夜节律主要传导者的传统观点，强调了其他信号通路（如摄食相关信号）和转录调控网络的补偿作用。该研究对于理解在生理稳态以及糖皮质激素治疗等病理状态下，肝脏代谢节律的维持和调控机制提供了新的视角，强调了在评估GR功能时考虑其冗余性和上下文依赖性的重要性。
