《Nature Communications》：Single-cell exon deletion profiling reveals splicing events that shape gene expression and cell state dynamics
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本研究开发了scCHyMErA-Seq平台，将CRISPR介导的外显子删除与单细胞转录组测序相结合，成功构建了可同时捕获Cas9/Cas12a向导RNA和polyA尾转录本的单细胞分辨率筛选体系。研究人员通过对224个选择性外显子进行高通量筛选，发现多个外显子对基因表达和细胞周期进程具有显著调控作用，并以NRF1外显子-7为例验证了其通过影响转录因子与靶基因启动子结合来调控转录活性的新机制。该研究为在单细胞水平系统解析选择性剪接的功能影响提供了重要技术平台。
在真核生物中，选择性剪接作为关键基因调控机制，能够从一个基因产生多个蛋白质异构体，极大丰富了蛋白质组的多样性。这一过程几乎影响所有蛋白质编码基因，不仅调控基因表达水平，更能通过生成不同蛋白异构体来精确调节基因功能，从而响应环境信号和细胞特异性需求。然而，大多数剪接变体的功能相关性仍不清楚，这成为RNA生物学和生物医学研究领域的重大挑战。尤其值得注意的是，选择性剪接的失调与多种疾病和障碍相关，包括癌症和自闭症，凸显了其在健康和疾病中的重要性。
传统CRISPR基因敲除方法中，单引导靶向外显子序列通常会产生移码突变或框内缺失，导致功能丧失或功能减弱的等位基因，这使得解释外显子特异性功能变得复杂。相比之下，CHyMErA（CRISPR混合多重编辑和筛选应用）平台能同时表达Cas9和Cas12a核酸酶以及杂交向导RNA（hgRNA），通过靶向侧翼内含子区域实现精确的外显子切除，同时保留周围的编码序列和阅读框。这种策略允许直接评估单个外显子对蛋白质功能的贡献。
尽管研究人员此前已经优化了CHyMErA系统，通过引入改良的Acidaminococcus sp（As）Cas12a变体显著提高了大规模外显子删除筛选的效率，并发现了数百个影响人类细胞适应性的外显子，但适应性表型是定量的，它们对外显子功能的机制洞察有限。更重要的是，改变适应性的外显子富含于基因表达调控相关基因中，这凸显了需要能够系统地将外显子扰动与复杂分子表型（如转录程序）联系起来的研究方法。
近年来，基因组编辑和单细胞技术的进步使得能够将集合遗传扰动与单细胞RNA测序（scRNA-Seq）结合。这些方法在捕获多聚腺苷酸化转录本的同时，通过条形码策略或直接测序嵌入在多聚腺苷酸化转录本中的gRNA来识别Cas9 gRNA。尽管这些方法很有用，但它们面临局限性，包括条形码与向导RNA解耦以及在部分CROP-Seq实施中gRNA检测效率低的问题，尽管靶向扩增sgRNA可以部分缓解后者。更近期的是，将捕获序列纳入tracrRNA的直接捕获策略能够实现Cas9 gRNA与多聚腺苷酸化转录本的同步检测。然而，类似的用于Cas12a gRNA的直接捕获解决方案尚属缺乏，也没有类似的用于外显子中心扰动筛选的框架。
为此，研究团队在《Nature Communications》上发表了题为“Single-cell exon deletion profiling reveals splicing events that shape gene expression and cell state dynamics”的研究论文，开发了单细胞CHyMErA测序（scCHyMErA-Seq）平台，该平台将高通量外显子删除与单细胞转录组学相结合，实现高分辨率表型分析。通过修改Cas12a直接重复（DR）序列并实施定制的cDNA扩增方案，该研究能够在标准10x Genomics工作流程中实现Cas12a gRNA的稳健捕获，同时提高编辑效率。
研究人员主要采用了几个关键技术方法：首先是改良的hgRNA支架设计，通过优化Cas12a直接重复序列（DRv10）和引入tevopreQ1核糖开关，显著提高了gRNA的稳定性和捕获效率；其次是单细胞转录组测序技术，使用10x Genomics平台进行液滴基单细胞捕获和测序；第三是CRISPR-Cas9/Cas12a组合编辑系统，实现精确的外显子删除；第四是功能验证实验，包括流式细胞术、Northern blot、Western blot等；最后是生物信息学分析，包括差异表达分析、聚类分析和功能富集分析等。实验使用了HAP1细胞系（人单倍体细胞系）和HEK293细胞系。
研究团队应用scCHyMErA-Seq筛选了224个选择性外显子，这些外显子来自161个基因，此前已被鉴定为影响细胞适应性。研究聚焦于能够产生替代蛋白质变体的保框外显子，并优先选择了在涉及转录表型的基因中的外显子。研究构建了一个包含1066个hgRNA的慢病毒文库，每个外显子由三个独立的向导对靶向，这些向导将Cas9和Cas12a导向侧翼的内含子区域。
scCHyMErA-Seq技术平台的优化与验证
研究人员通过系统优化hgRNA设计，解决了Cas12a gRNA在单细胞测序中捕获效率低的问题。最初的设计在Cas12a gRNA的3'端附加 distinct 捕获序列（CS2），但在测试中发现这种设计导致Cas12a gRNA的捕获效率为0%。进一步分析表明，CS的引入会明显降低CHyMErA的编辑效率和Cas12a gRNA丰度。通过引入tevopreQ1核糖开关和优化直接重复序列（DRv10），研究人员成功将Cas12a gRNA的检测效率提升至61%，再通过定制化扩增策略，最终实现约90%的捕获效率。
外显子删除对转录程序的调控作用
通过分析212,217个高质量单细胞的数据，研究发现103个基因（64%）和101个外显子（45%）的扰动显著改变了至少200个基因的表达。其中，TAF5外显子-8的删除影响了1908个差异表达基因，CREBBP外显子-25影响了2184个基因，EXOSC5外显子-4影响了844个基因，NRF1外显子-7影响了386个基因。这些扰动富集于代谢通路、应激反应和信号级联等生物学过程。
外显子特异性调控机制的发现
研究发现了多个外显子具有独特的调控功能。例如，LSM11外显子-3的删除导致复制依赖性组蛋白转录本检测增加，这与U7 snRNP功能受损一致。类似地，TAF5外显子-8删除也导致组蛋白转录本表达增加，表明其在组蛋白3'端加工中的共同作用。这些发现揭示了外显子在精细调控特定生物学过程中的重要作用。
NRF1外显子-7在转录调控中的关键作用
研究人员重点研究了NRF1外显子-7的功能。该外显子编码66个氨基酸片段，部分重叠于NRF1的DNA结合域。通过ChIP-Seq分析发现，外显子-7的缺失导致NRF1在靶基因启动子上的占据显著减少。进一步实验表明，SRSF3是促进内源性外显子-7包含的关键因子，证明了剪接调控在转录因子功能中的重要性。
外显子删除对细胞周期的影响
通过单细胞水平分析细胞周期分布，研究发现了69个外显子和76个基因的扰动显著改变了细胞周期分布。这些外显子富集于核糖体生物发生、蛋白质合成和RNA降解等功能类别，揭示了外显子在细胞周期调控中的重要功能。
与正交方法的比较验证
研究团队通过多种正交方法验证了scCHyMErA-Seq结果的可靠性。与基因组规模的Perturb-seq数据集比较显示，差异表达基因存在显著重叠，且转录反应具有强一致性。与外显子救援和碱基编辑方法的比较也证实了scCHyMErA-Seq检测外显子特异性表型的能力。
研究结论表明，scCHyMErA-Seq成功建立了一个多功能平台，能够系统解析外显子水平扰动对转录组的影响。该技术不仅揭示了外显子在基因调控网络中的特异性功能，还为理解选择性剪接在细胞命运决定中的作用提供了新的视角。特别重要的是，研究发现外显子水平的扰动可以微调蛋白质功能，产生与基因敲除仅部分重叠的转录结果，且这些结果依赖于细胞状态。
这项研究的重要意义在于：首先，技术上突破了单细胞水平外显子功能筛选的技术瓶颈，为系统研究选择性剪接的功能后果提供了强大工具；其次，发现了多个具有重要调控功能的外显子，为理解基因表达调控的精细机制提供了新见解；最后，研究揭示了外显子特异性调控在细胞周期进程等重要生物学过程中的作用，为疾病机制研究和治疗靶点发现提供了有价值的信息。该平台的模块化和可扩展性使其成为组合遗传扰动研究的多功能工具，包括遗传相互作用作图和特定基因组元件的靶向 interrogation。
