《Nature Communications》：Splice isoform-perturbation coupled to single cell transcriptome profiling reveals functions of microexons in neurogenesis and autism-linked pathways
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本研究针对神经元特异性微外显子的功能解析难题，开发了CHyMErA-seq单细胞转录组扰动筛选平台，通过系统性删除小鼠神经发生过程中的关键微外显子，发现其通过调控FAK-ERK等信号通路精确控制神经发生转录组时序，揭示微外显子错接与自闭症等神经发育障碍的病理关联。
在哺乳动物神经系统中，超过95%的多外显子基因会发生选择性剪接，产生大量功能未知的转录本变异体。其中，长度仅3-27核苷酸的"微外显子"在神经元中高度富集，但其功能解析面临巨大挑战：传统的功能缺失研究通常靶向整个基因，无法区分不同异构体的特异性功能；而神经元发育的高度异质性要求单细胞水平的分辨率。
为解决这一难题，研究人员开发了CHyermA-seq（Cas Hybrid for Multiplexed Editing and single-cell RNA-seq Application）平台，将CRISPR-Cas9/Cas12a介导的外显子特异性删除与单细胞核RNA测序相结合。该研究发表于《Nature Communications》，首次在单细胞水平实现了异构体分辨率的功能基因组学筛选。
研究团队通过优化Cas12a核定位信号，显著提高了微外显子删除效率。实验采用分裂-池单核RNA测序（sci-RNA-seq3）技术，在体外神经分化模型（从胚胎干细胞到培养第7天的神经元）中，对37个神经元特异性微外显子进行系统性扰动。这些微外显子选自与神经发育密切相关的基因，如调控细胞粘附、信号转导和转录调控的关键因子。
关键技术方法
研究主要通过以下技术方法实现：①利用改造的CROP-seq载体表达杂交向导RNA（hgRNA），同时实现基因组编辑和转录组标记；②应用单细胞RNA测序在21,000个细胞核中分析转录组表型；③通过CellRank2进行细胞命运映射和伪时间分析；④采用SCENIC分析基因调控网络活性；⑤结合免疫印迹验证信号通路变化。
研究结果
单细胞外显子分辨率功能基因组学平台的建立
研究人员将CHyMErA系统与分裂-池单核RNA测序结合，通过改造的CROP-seq慢病毒载体，在3'长末端重复序列中整合hgRNA表达盒。测序结果显示，98.8%的向导序列读数在平均值10倍范围内，表明文库覆盖均匀。细胞聚类分析识别出神经上皮、放射状胶质细胞和神经元等不同发育阶段群体。
微外显子删除相关的神经元转录组特征检测
通过伪批量（pseudobulk）差异表达分析，发现10个微外显子的删除产生显著转录组表型。引导RNA相关性分析证实，靶向相同微外显子的细胞显示高度相似的基因表达模式。特别值得注意的是，微外显子删除并未影响宿主基因的整体表达水平，表明观察到的表型确实源于剪接变异而非基因敲除效应。
微外显子删除影响神经发生相关的转录组特征
进一步分析发现，微外显子删除导致神经发生相关基因程序的时序性紊乱。例如，删除Bin1、Clasp1、Gfra1、Med23、Ptprf和Ralgapb等基因中的微外显子后，上调基因显著富集于高CellRank2评分的基因，这些基因与神经发育晚期阶段相关。功能富集分析显示，差异表达基因主要涉及神经系统发育、神经元投射导向等生物学过程。
Gfra1微外显子调控神经元投射发育
针对GDNF（胶质细胞源性神经营养因子）共受体GFRA1中的微外显子进行深入研究，发现其删除导致神经元分化相关基因提前上调。免疫荧光实验证实，删除该微外显子的神经元在培养第7天表现出更长的神经突。机制上，该微外显子通过调控FAK（局部粘着斑激酶）Y397位点磷酸化，影响下游ERK（细胞外信号调节激酶）信号通路活性。
神经发生中微外显子通过调控FAK信号通路发挥功能
对Clasp1基因中一个未被表征的微外显子进行深入研究，发现其删除显著改变转录组特征。强迫该微外显子跳读的神经元显示FAK磷酸化水平增加，进而激活ERK信号。这表明Clasp1微外显子作为"分子刹车"，通过调控细胞骨架重塑相关信号通路来控制神经发生时序。
神经元微外显子控制与自闭症相关的基因表达签名发育时序
通过SCENIC分析，发现微外显子删除细胞中6个与自闭症相关的调节子（包括Sox6、Ets2、Egr1、Elk1、Foxp1和Sin3a）活性发生显著改变。其中Egr1调节子在8个微外显子删除中均有失调，该因子已知通过诱导p35（CDK5的神经元特异性激活剂）来调控神经突生长。对SFARI（Simons基金会自闭症研究计划）基因模块的分析进一步显示，微外显子删除导致自闭症风险基因提前激活。
研究结论与意义
本研究通过开发CHyMErA-seq平台，实现了在单细胞水平对异构体功能进行系统性解析。发现神经元微外显子作为关键时序调节因子，通过调控FAK-ERK等信号通路精确控制神经发生过程。多个微外显子的功能缺失会导致与自闭症等神经发育障碍相关的转录组特征紊乱，为理解相关疾病的分子机制提供了新视角。该研究不仅建立了研究选择性剪接功能的新方法，还揭示了微外显子在神经发育中的重要作用，为未来治疗干预提供了潜在靶点。
研究还发现，Ptprf、Ptk2等基因中的微外显子在双相情感障碍和精神分裂症患者大脑中存在错接现象，进一步强调了微外显子调控在神经精神疾病中的广泛意义。这些发现为理解神经发育疾病的分子基础提供了重要线索，也为未来开发针对特定异构体的治疗方法奠定了基础。
